很多蛋白质功能是通过形成蛋白质复合体及其蛋白质-蛋白质间的相互作用共同实现的。蛋白质-蛋白质间的相互作用分析是功能基因组学及蛋白质组学的重要研究内容之一，是了解蛋白功能的途径之一。现在研究蛋白-蛋白相互作用的主要的方法是酵母双杂交，但该方法的主要缺点是其较高的假阳性和假阴性结果，需要进一步的实验来验证分析。因此，本研究联合运用分子克隆等分子生物学技术与亲和纯化、氨基酸代谢标记(稳定同位素标记)及质谱等分析化学技术，主要发展了蛋白质复合体串联亲和纯化(TAP)方法，以及蛋白质-蛋白质相互作用研究的“氨基酸代谢标记-串联亲和纯化-质谱新技术(AACT-TAP-MS)”，和基于氨基酸代谢标记技术的免疫共沉淀(AACT-IP)新方法；并在人肝癌细胞系中分别运用发展的TAP，AACT-TAP-MS方法分离鉴定了14-3-3(epsilon)蛋白复合体。本文研究内容主要集中在以下几个方面： 1.改进发展适合于高等哺乳动物细胞的新的TAP系统和技术分离纯化蛋白复合体。建立蛋白混合物经过“Flag-antiFlagM2”和“钙调素结合肽-钙调素”两次不同的亲和结合、TEV酶酶切和SDS洗脱而分离纯化蛋白复合物的新TAP方法，可在生理条件下简单快速分离得到蛋白质复合物。与Rigaut当初在酵母中建立的“ProteinA-IgG”和“CBP-CM”的TAP方法相比，主要是在TAPtag载体中用两个短的8肽Flag序列取代了ProteinA序列，分子量减小有利于靶蛋白与TAPtag载体更有效融合表达，且通过anti-Flag抗体来分离复合物特异性更强，有效减少非特异性蛋白的结合。 2.将蛋白定量分析的“氨基酸代谢标记-质谱技术”(AACT-MS)，与有效分离蛋白复合物的串联亲和纯化标签(TAPtag)方法有机整合发展，建立了d3-Leu氨基酸代谢标记-串联亲和纯化-质谱新技术(AACT-TAP-MS)进行蛋白复合物分离纯化、蛋白鉴定及绘制蛋白间直接相互物理作用图谱的一体化新技术，提高蛋白质鉴定和定量分析的灵敏度和准确性。AACT-TAP-MS新技术也为建立大规模、高通量、快速准确分析研究人类重要功能蛋白质连锁网络提供新的技术体系。 3.选择人类重大疾病肝癌为研究对象，以人肝癌细胞为靶细胞，运用发展的AACT-TAP-MS新技术，从蛋白质间的相互作用、协同发挥功能的新角度，分离与肝癌发生发展密切关联的蛋白14-3-3的复合物，鉴定了14-3-3zeta，14-3-3theta，actin，Bipprotein及HSP70等蛋白与14-3-3ε存在特异性相互作用。本研究可为肝癌的早期诊断、预后寻找新的侯选蛋白标记物提供新方法。 4.发展了基于氨基酸同位素代谢标记技术的免疫共沉淀新方法来分离蛋白质复合体、分析蛋白质-蛋白质间相互作用。运用建立的AACT结合co-IP方法，鉴定出了与目的蛋白14-3-3β特异性相互作用的HSP90A，glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，14-3-3tau等蛋白。 总之，本研究工作不仅在蛋白质复合物分离以及与AACT-MS联用的方法学和研究蛋白质功能上具有重要的科学意义，可为哺乳动物细胞中其他蛋白复合物的TAP法纯化，研究蛋白-蛋白相互作用提供新的技术方法。AACT-TAP-MS可为我国正在开展的“中国人类肝脏蛋白组计划”及包括中国参与的国际合作项目“人类肝脏蛋白组计划”中研究内容之一—绘制“人类肝脏蛋白质相互作用连锁图”，建立大规模、高通量、快速准确分析研究人类重要功能蛋白质连锁网络提供新的技术体系。本课题的研究思想和方法代表了系统生物学中有关蛋白组学研究方法的概念性革新。