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研究背景银屑病是一种常见的免疫介导的慢性炎症性皮肤病,其病理特征为表皮角质形成细胞异常增生,细胞分裂周期及表皮细胞更替时间缩短,临床表现以红斑、鳞屑性损害为主,病程长,反复发作,严重影响患者的生活质量。本病发生与遗传、环境、免疫、感染、心理因素等多种因素相关,发病机制尚未完全阐明,目前暂无治愈的方法。因此探究银屑病的发病机制是国内外皮肤病专家研究的热点和难点。近来研究认为银屑病的发生是在遗传因素的基础上,感染、精神创伤、外伤等各种因素诱导机体多种免疫细胞的调控失常,导致炎症性细胞因子的释放,进而使机体的先天性与获得性免疫功能发生障碍,而致相关炎症细胞浸润,最终发生银屑病的特征性病理改变:角质形成细胞的增生和异常分化,免疫炎症细胞移入表、真皮。但是目前导致表皮缺陷和免疫功能障碍的潜在机制未有探明。随着国内外学者在小分子领域研究的不断深入,在皮肤的生理病理过程中发现多种microRNA(miRNA)起着极其重要的调控作用,某些皮肤病如皮肤肿瘤、特应性皮炎及银屑病的皮损中发现了特异表达的miRNA。通过高通量测序、定量聚合酶链反应及桥梁同位素标记等技术,许多与银屑病相关的miRNA被筛选和验证。虽然研究发现miRNA通过影响角质形成细胞增殖、分化、促进炎症反应、干扰免疫细胞的形成等作用在银屑病的发病中发挥重要的作用,但是目前大多数研究针对miRNA表达水平的检测,对其调控机制大多未明,尚需大量数据支持,建立基因表达数据库,探寻与银屑病发病密切相关的miRNAs,为本病诊治及预防提供新靶点及依据。研究目的通过miRCURY LNATM microRNA Array基因芯片技术筛选银屑病患者皮损表皮与正常对照者表皮组织中差异表达的miRNAs;运用生物信息学技术及分子生物学实验方法探究在银屑病皮损表皮中明显下调的miR-320b在诱导原代角质形成细胞(normal human epidermal keratinocytes,NHEKs)增殖中的作用机制。第一部分银屑病皮损表皮中异常表达microRNAs的筛选及验证研究方法1.收集10例银屑病患者皮损及10例健康对照者皮肤组织,经福尔马林固定后石蜡包埋。选择性别、年龄及取材部位相匹配的8例样本(银屑病患者与健康对照者各4例)TRIzol法从石蜡组织中提取RNA。2.采用 miRCURY LNATM microRNA Array(v.18.0)(Exiqon)基因芯片技术对银屑病患者皮损表皮与健康对照者表皮提取的RNA进行miRNAs的表达谱系差异分析。使用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片,GenePix Pro 6.0读取探针信号值,取得的原始值进行中值标准化。使用Fold change和P-value筛选两组样品间差异表达miRNAs。3.挑选6个明显差异表达的miRNA采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测验证miRNA微阵列结果。以U6作为内参,使用2-△△CT法计算miRNA的相对表达水平。4.另外选取12例样本(银屑病患者及健康对照者各6例)石蜡组织,提取RNA,RT-qPCR检测差异表达明显的miR-320b、miR-1246的表达水平,以U6作为内参,使用2-△△C△法分析计算数据,进一步验证芯片结果。结果1.通过miRCURY LNATM microRNA Array基因芯片技术检测和分析8例样本(银屑病患者皮损和健康对照者皮肤各4例)表皮组织中差异性表达的miRNAs,对芯片结果进行分析,两组样本间差异表达的miRNA共有243个;其中Fold Change,(FC)≥1.5,P-value≤0.05表达差异miRNA共116个,表达上调的45个(占35.7%,表达下调的71个(占56.3%)。2.RT-qPCR检测6个明显差异表达miRNA的表达水平,与对照组相比,miR-1246,let-7d-3p,均表达上调(P<0.05,P<0.01);miR-30d-5p,let-7g-5p,miR-320b均表达下调(P<0.05,P<0.01),与基因芯片结果一致。miR-4475的表达水平两组无统计学差异。3.RT-qPCR检测另外12例样本(银屑病患者皮损和健康者皮肤各6例)表皮组织中miR-1246及miR-320b的表达水平,结果显示,与健康对照组相比miR-1246表达上调1.98倍(P<0.01),miR-320b表达下调0.26倍(P<0.01)。第二部分microRNA-320b在角质形成细胞中的表达及对其增殖的影响研究方法1.体外培养NHEKs,经2-3次传代获得纯化的NHEKs,选择第3代NHEKs予验证后进行后续实验。2.细胞沉淀中提取RNA,逆转录获得互补DNA。U6用作参照基因使样品标准化,行RT-PCR检测,2-△△CT方法分析数据。3.构建低表达的miR-320b慢病毒载体,转染至NHEKs中,下调细胞中miR-320b的表达水平,同时设立慢病毒阴性对照组。4.NHEKs转染1、2、3、4天,3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide,MTT)检测体外细胞增殖活力。5.NHEKs 转染 1、2、3、4 天,溴脱氧尿苷染色(Bromodeoxyuridine,Brdu)进一步检测体外细胞增殖活力。结果1.使用U6作为标准化的内参,RT-PCR检测NHEK中miR-320b呈高表达。2.MTT检测结果显示:转染第4天,与正常对照组(NC)相比,miR-320b低表达实验组(Down)细胞增殖活力水平显著升高(P<0.001)。3.Brdu检测显示,转染第4天,miR-320b低表达实验组(Down)细胞增殖活力水平较正常对照组(NC)显著升高(P<0.05)。第三部分 microRNA-320b 调控 STAT3/SAPK/JNK 对角质形成细胞增殖的作用研究方法1.应用生物信息数据库Miranda及Targetscan2种microRNA 靶基因预测软件对miR-320b进行靶基因预测。2.通过在线软件(http://www.targetscan.org)预测miR-320b与 AKT3 的结合位点,将AKT3的miR-320b结合位点突变(pMIR-REPORT Luciferase-AKT3-3’UTR(MT))和野生型(pMIR-REPORT Luciferase-AKT3-3’UTR(WT))序列插入到报告质粒中。分别将野生型或突变型双报告载体与miR-320b mimics及阴性对照(mimics control)共转染入293T细胞中,在双荧光素酶报告检测仪下检测各组细胞的荧光酶活性。3.将miR-320b抑制物(miR-320b inhibitor)及阴性对照(miR-320b inhibitor control)转染至NHEKs,48小时后蛋白质印迹(Western blot)检测两组靶基因AKT3蛋白表达水平,以GAPDH作为内源对照,验证mir320b对靶基因AKT3的调控作用。4.使用 Cell Signaling Technology(CST)公司的 PathScan(?)Antibody Array Kit,检测和比较miR-320b低表达实验组和对照组中信号通路关键信号分子的变化,分析miR-320b可能调控的信号通路。结果1.利用Miranda和Targetscan 2种microRNA靶基因预测软件分别得到5982个和1573个潜在靶基因,取两者靶基因的交集得到553个交集靶基因,包括AKT3、PTEN、CMPK1、RUNX1等。查阅文献选择与细胞增殖相关的AKT3进一步研究。2.双萤光素酶报告基因系统检测结果显示:共转染miR-320b mimics和pMIR-REPORT Luciferase-AKT3-3 ’ UTR(WT)细胞组及 miRNA-320b mimics和pMIR-REPORTLuciferase-AKT3-3’UTR(MT)细胞组的荧光素酶活性较其他2组明显降低(P<0.0001),而在结合位点突变后,这种调控关系没有明显变化(p=0.0507)。3.Western blot检测结果显示:相对于正常对照组,miR-320b低表达实验组的靶基因AKT3蛋白表达水平升高。4.NHEKs慢病毒转染下调miRNA-320b后,pathscan检测细胞内信号通路中相关基因,通路中STAT3,SAPK/JNK蛋白的磷酸化水平显著上调。结论1.与健康对照组相比,miR-3 20b在银屑病皮损表皮组织中低表达2.下调miR-320b的表达可促进角质形成细胞增殖3.AKT3为miR-320b调控的靶基因4.下调miRNA-320b,STAT3/SAPK/JNK蛋白的磷酸化水平上调5.miR-320b可能通过靶向AKT3调控STAT3/SAPK/JNK磷酸化水平促进角质形成细胞增殖