论文部分内容阅读
本研究以一株采自云南西部山区，次生代谢产物为苝醌类衍生物光敏剂的丝状真菌AL18为实验材料，在确立了其总RNA提取方法的基础上，构建了cDNA文库，主要结果如下：
1.为克服RNA易降解，丝状真菌富含RNase(RNA酶)和多糖的困难，在参考不同实验材料的总RNA提取方法的基础上，通过实验确立了采用异硫氰酸胍和β-巯基乙醇联合变性，酚、氯仿、异戊醇多次抽提，使RNA留在水相而DNA和蛋白质进入有机相，然后用异丙醇沉淀RNA的方法，得到了完整、均一的总RNA，质量能够满足构建cDNA文库的要求。
2.利用MMLV反转录酶把总RNA中的mRNA反转录成cDNA，用特异引物进行LD-PCR扩增合成双链cDNA；用CHROMASPIN-400Column对cDNA进行分级分离，去除小于500bp的cDNA片段；用带有粘性末端的双链cDNA与λTriplEx2载体连接，利用λ噬菌体包装蛋白对合成的双链cDNA进行体外包装，包装产物侵染E.coliXL-Blue获得cDNA文库。该cDNA文库的滴度为1.04×106pfu/ml，扩增后文库的滴度为1.32×1010pfu/ml，蓝白斑筛选证实其重组率为82％。同时，由于反转录过程中采用附加序列的方法使全长mRNA得到反转录，所以得到的cDNA是完整的，有利于各种基因的全长cDNA的获得。为筛选文库克隆苝醌类光敏剂生物合成中的聚酮合成酶基因以及在后续工作中克隆聚酮合成酶的全基因簇打下坚实的基础。