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缺血性脑卒中（Ischemic Stroke,IS）是脑血管疾病中最为常见的疾病,具有发病率高、后遗症多、死亡率较高等特点,其中大动脉粥样硬化型卒中（large-artery atherosclerosis,LAA）的发病率最高,可达11.8%。本研究拟用生物信息学这一门结合了生命科学和信息技术的新学科,分析在大动脉粥样硬化型脑卒中患者的差异micro RNA（mi RNA）表达谱,并研究探讨其在卒中疾病中可能参与的生物学过程、细胞组成、信号通路等,从基因水平研究大动脉粥样硬化型急性缺血性脑卒中的病理机制,为该疾病的预防、诊断及治疗提供新思路。IS后局部脑组织缺血缺氧,正常脑组织能够生出新生血管至梗死区来改善局部的血液灌注,进而保护神经结构完整性,减少梗死面积。截止到今日为止,有少量文献报道mi RNA通过调控血管生成,进而影响IS的康复和预后,本实验拟通过对比急性大动脉粥样硬化型缺血性卒中差异表达的mi RNA与Gene Cards数据库中已知的大动脉粥样硬化型脑卒中mi RNA筛选出共同差异表达的mi RNA,并在体外研究其对大动脉粥样硬化型脑卒中血管生成的影响并分析其机制。第一部分基于生物信息学分析的大动脉粥样硬化性缺血性卒中的micro RNAs表达谱的研究目的:应用生物信息学分析技术,筛选急性大动脉粥样硬化型缺血性卒中组与同期健康体检对照组的差异mi RNA表达谱差异基因,研究差异表达的mi RNA在大动脉粥样硬化型脑卒中可能参与的相关的关键信号通路和关键基因。方法:1.选取中国人民解放军联勤保障部队第九八一医院就诊的LAA型AIS患者12例,同一阶段进行健康体检的志愿者15例,采用高通量mi RNA芯片技术,对入选对象血浆中mi RNA的表达谱进行检测,采用Gene Spring软件筛选出在LAA型AIS中出现的特异表达的mi RNA。2.采用Fun Rich软件预测特异表达mi RNA的前10位上游转录因子。3.采用mi RNet数据库预测特异表达mi RNA的靶基因。4.应用R软件中的limma程辑包,对GSE16561数据集的基因表达矩阵进行分析,筛选差异表达基因,并与特异表达mi RNA的靶基因取交集,筛选出最终靶基因。5.使用Bioinformatics数据库,对特异表达mi RNA的最终靶基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。6.使用String数据库构建特异表达mi RNA靶基因的蛋白质互作网络,并应用Cytoscape软件制作蛋白质互作网络图。结果:1.与健康体检志愿者组相比,LAA组共有27个mi RNA出现差异表达,其中20个mi RNA上调,7个mi RNA下调。2.转录因子预测结果表明,前10个转录因子分别为EGR1、SP1、SP4、TCF3、EOMES、RREB1、ZEB1、NANOG、CTCG、MYF5。3.靶基因预测结果显示,20个mi RNA上调,共靶向5885个独立靶基因,7个mi RNA下调,共靶向1365个独立靶基因。4.同GSE16561数据集的差异基因进行交集,发现上调的差异m RNA与预测的上调m RNA共有25个基因、下调的差异m RNA与预测的下调m RNA共有44个基因。5.Bioinformatics分析显示靶基因GO分析可富集到T细胞分化、黏着斑等功能簇;KEGG分析可富集到紧密连接、m TOR等通路。结论:大动脉粥样硬化型脑卒中患者存在27个差异表达mi RNA,可通过多种信号通路调控血管新生、免疫调节、炎症、凋亡等过程,参与卒中的发生、发展与预后,其中PI3K及m TOR作为IS治疗潜在靶点的可能性大。第二部分mi R-296-5p对大动脉粥样硬化型脑卒中血管生成的影响及机制研究目的:筛选出共同差异mi RNA,研究其对急性大动脉粥样硬化型缺血性卒中血管生成的影响并分析作用机制。方法:1.对比急性大动脉粥样硬化型缺血性卒中差异表达的mi RNA与Gene Cards数据库中已知的大动脉粥样硬化型脑卒中mi RNA筛选出目标mi RNA;2.应用mi RNet、starBase、mi RPath DB、mi RWalk 4个数据库预测目标mi RNA下游靶基因;3.利用DAVID在线分析平台,对目标靶基因进行GO功能富集分析与KEGG通路分析;4.使用String数据库构建mi RNA靶基因的蛋白质互作网络,并应用Cytoscape软件制作蛋白质互作网络图;5.HUVEC细胞中使用腺病毒rAd-hsa-mi R-296-5p过表达mi R-296-5p,荧光显微镜下观察转染效果,q-PCR检测是否成功过表达;6.血管生成实验检测mi R-296-5p对血管生成的影响;7.采用Western Blot和q PCR方法,检测STAT3、PLK1的表达。结果:1.GeneCards数据库共筛选出相关性大的mi RNA 2个,分别为mi R-98、mi R-296,其中mi R-98同以往研究大动脉粥样硬化型脑卒中患者体内表达趋势相反,最终确定mi R-296-5p为目标mi RNA;2.mi RNet、starBase、mi RPath DB、mi RWalk共4个数据库同时预测靶基因153个;3.靶基因GO分析可富集到蛋白磷酸化、外泌体等;KEGG可富集到AMPK等通路;4.排除不具有互作关系的靶蛋白49个后,获得了具有104个节点161条相互作用的蛋白互作图谱;5.mi R-296-5p抑制血管生成;6.mi R-296-5p过表达后,STAT3、PLK1在RNA水平、蛋白水平的表达下降。结论:mi R-296-5p可能通过抑制STAT3、PLK1表达来抑制血管生成,mi R-296-5p有望成为大动脉粥样硬化型脑卒中的干预靶点。