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去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)较激素敏感性前列腺癌(hormone-sensitive prostate cancer,HSPC)治疗难度大,且预后较差,因此有必要开拓新的治疗方法,而基因疗法则是目前较为热门的治疗恶性肿瘤的方法,引起科研工作者的广泛关注。基因疗法是将目的基因以合适的载体导入到靶细胞中,修复相关的基因缺陷,达到治疗肿瘤的目的。本研究旨在构建一种受人端粒酶逆转录酶启动子(human telomerase catalytic subunit,hTERT)和 zeste 增强子同源物 2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)-短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)(以下简称EZH2-shRNA)双调控的条件复制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus,CRAds,以下简称腺病毒),通过靶向抑制 CRPC细胞增殖及侵袭能力,从而实现安全、高效、稳定治疗CRPC的目的,为CRPC的精准基因治疗提供实验基础。目的:检测人前列腺组织中EZH2蛋白的表达水平。通过构建由hTERT和EZH2-shRNA双调控的腺病毒,探讨腺病毒对CRPC细胞增殖及侵袭能力的影响,为CRPC的精准基因治疗提供实验基础。方法:获取CRPC、良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)、HSPC患者的前列腺组织样本,采用免疫组织化学方法检测3组样本中EZH2蛋白的表达水平。构建一种由hTERT和EZH2-shRNA双调控的腺病毒,设计两条shRNA(即3hRNA1、shRNA2),用增殖实验(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测含两种不同shRNA的腺病毒对PC-3细胞增殖能力的干扰效果,筛选出干扰效果较好的shRNA进行后续实验。使用干扰效果较好的腺病毒去转染人肺腺癌A549细胞,通过镜下观察细胞被转染后的荧光图像,观察腺病毒是否构建成功。使用筛选出的腺病毒去转染PCa细胞(PC-3及DU145)。CCK-8实验及侵袭实验(Transwell)检测腺病毒转染前后PC-3和DU145细胞的增殖和侵袭能力。Western blot实验来检测腺病毒转染前后PC-3与DU145细胞中EZH2、CCND1、Ki-67及E-cadherin蛋白的表达。结果:1.免疫组化方法检测显示:与BPH患者标本相比,EZH2蛋白在HSPC和CRPC患者标本中表达明显上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。同时,在不同类型的PCa标本中(CRPC与HSPC),对EZH2蛋白的表达量进行评分,EZH2评分较低部分中HSPC占比较大,而EZH2评分较高部分中则CRPC占比较大。两组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.基因测序证明单克隆抗体中shRNA及hTERT序列的正确性,表明单克隆载体构建成功。CCK-8法检测shRNA1和shRNA2对PC-3细胞增殖的干扰效果,结果显示,shRNA2抑制PC-3细胞增殖的效率更高。同时,我们使用携带EZH2-shRNA2及hTERT基因的腺病毒去干扰A549细胞,24 h、48 h、72 h后的荧光分析显示转染的细胞随时间逐渐增加,间接表明我们成功构建了腺病毒载体。3.Transwell侵袭实验结果表明,实验组(经腺病毒转染的细胞组)培养48 h后可显著抑制PCa细胞(PC-3和DU145)的侵袭能力,表明腺病毒对PCa细胞的侵袭能力具有显著抑制作用。实验组与对照组(未经腺病毒转染的细胞组)相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.CCK-8结果显示,在PC-3及DU145细胞中,与未经转染的细胞相比,腺病毒转染PCa细胞后能显著抑制细胞的增殖能力(P<0.05)。5.Western blot结果显示,当EZH2蛋白的表达被抑制时,Ki-67及CCND1的表达也相应下降。相反,E-cadherin的表达增加。结论:1.EZH2蛋白在人前列腺癌组织中表达水平增高,且CRPC组织中EZH2蛋白较HSPC中表达上调明显。2.比较免疫组化检测中EZH2蛋白强度评分,EZH2蛋白在HSPC与CRPC组织中表达差异明显。3.成功的构建了能够在PCa细胞中稳定表达的CRAds。4.hTERT及EZH2-shRNA双调控的CRAds能够抑制人PCa细胞的增殖及侵袭能力,表现出显著的抗肿瘤作用。5.EZH2蛋白表达水平下调引起Ki-67、CCND1蛋白表达水平下调,同时E-cadherin蛋白表达水平上调。