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叶黄素是具高附加值的类胡萝卜素,它是天然的着色剂且具有强抗氧化性,在食品和医药等领域被广泛运用。目前,叶黄素主要从万寿菊中提取,但容易受到季节变化等众多因素的限制,所以叶黄素需求依旧是目前亟需解决的问题。而小球藻生长迅速、能异样培养并且能合成游离叶黄素,是一类具有很大潜力的叶黄素生物源。番茄红素ε-环化酶(LCYE)是类胡萝卜素通路中的关键酶,能催化番茄红素进行环化作用,影响代谢通路中叶黄素的合成。本研究以小球藻(Chlorella vulgaris)F197的番茄红素ε-环化酶基因(CvLCYE)为研究对象,通过对CvLCYE基因克隆和特征分析,以及体外酶活性和体内异源表达等研究,揭示CvLCYE基因与叶黄素生物合成的代谢机制。实验获得的具体结果如下:克隆小球藻LCYE基因,并对其进行亚细胞定位。1)基因全长3094 bp,含6个外显子、5个内含子;cDNA全长2017 bp,其中5′UTR 82 bp,3′UTR 330 bp,CDS 1605bp。2)该基因与变异小球藻(Chlorella variabilis)和佐夫小球藻(Chlorella zofingiensis)的LCYE基因结构相近,其中与变异小球藻的同源性最高,相似性达81.57%。3)小球藻LCYE蛋白的二级结构富含β-环(Loop,58%)与α-螺旋(helix,33%),β-折叠(strand)占9%;此外,小球藻LCYE与其他微藻的LCYE具有亲缘关系,它们应该起源于同一个共同的祖先,其中与变异小球藻和原始小球藻(Auexnochlorella protothecoides)的亲缘关系最为密切。4)构建了基因与绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达载体,在拟南芥原生质体进行亚细胞定位实验,结果表明小球藻LCYE主要定位在叶绿体被膜上。大肠杆菌中异源表达LCYE基因,通过LCYE对底物番茄红素的催化分解能力来探究其酶活性。1)分别克隆小球藻(C.vulgaris)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、佐夫小球藻(C.zofingiensis)、原始小球藻(A.protothecoides)的LCYE并标记为CvLCYE、CrLCYE、CzLCYE、ApLCYE。2)构建至载体中,与pACCRT-EIB(使菌体积累番茄红素)共转化大肠杆菌。3)高效液相色谱测定菌体中的番茄红素剩余量,其中ApLCYE和CvLCYE的酶活性很强能高效消耗底物番茄红素,番茄红素的含量分别是野生型的0.14、0.20倍;CzLCYE的效果次之,番茄红素的含量是野生型的0.88倍,CrLCYE则无明显效果。为探究基因在微藻体内的功能,本研究首先在莱茵衣藻中异源过表达CvLCYE基因,结果表明过表达CvLCYE基因能提高转化子藻株叶黄素的积累,最高的是野生型的2.32倍;接着在小球藻自身过表达CvLCYE基因也能明显提高转化子的叶黄素含量,其中最高的是野生型的1.81倍。实验结果证明,CvLCYE基因的过表达能明显增强微藻叶黄素的生物合成。