论文部分内容阅读
奶牛骨代谢性疾病（bone metabolic disease,BMD）是包括软骨症、佝偻病、产后瘫痪、产褥热等一系列由钙磷代谢紊乱引起的营养代谢病。胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor,IGF）-I是骨骼生长和矿化中钙磷代谢调节的关键因子,人类临床研究表明其与骨代谢性疾病密切相关。本研究从下述四个方面探讨IGF-I对奶牛骨代谢病中的影响及其机制。1.奶牛血浆IGF-I的测定及其与骨代谢相关因子的关系设计了三个独立的试验以探讨IGF-I与奶牛钙磷代谢相关因子的关系。试验I检测不同泌乳阶段钙、磷、IGF-I、甲状旁腺激素（parathyroid hormone,PTH）、降钙素（calcitionin,CT）等骨代谢相关因子水平,试验Ⅱ检测不同年龄奶牛骨代谢相关因子水平,试验Ⅲ检测奶牛骨代谢病与相关因子的关系。结果显示,奶牛年龄、妊娠状况及血浆IGF-I、PTH、CT水平与机体钙磷水平密切相关,血浆Ca、IGF-I、P、ALP、PTH水平与骨代谢性疾病相关,此外IGF-I与Ca、P正相关（r=0.390,P=0.049;r=0.359,P=0.044）,PTH负相关（r=—0.790,P=0.002）。提示IGF-I与奶牛钙磷代谢密切相关,可以作为诊断奶牛骨代谢病的特异生化标志物。2.奶牛成骨细胞的体外培养、鉴定及生物特性研究采用胰蛋白酶-组织块移性法获取的细胞具有典型的成骨细胞形态和特性:ALP染色呈阳性,活性水平较高;培养7d后可检测到OC mRNA表达,12d后细胞上清液中可检测到OC蛋白;诱导培养2w后细胞可形成钙化结节。提示本实验室建立的方法所培养的细胞具有成骨细胞特性,可获得高纯度、高活性的奶牛成骨细胞。3.IGF-I对奶牛成骨细胞增殖、分化、矿化及重建的影响研究外源性IGF-I对体外培养的奶牛成骨细胞增殖、分化、矿化及重建的影响。结果显示,1-200ng/mL IGF-I均能促进奶牛成骨细胞增殖,100ng/mL组具有最大刺激效应,且IGF-I干预组细胞光密度值（optical density value,OD）从第1d到第5d逐渐增加,第7d降低。与对照组相比,10ng/mL与100ng/mL IGF-I均可显著诱导ALP活性、OC水平以及基质钙含量,钙化结节数量增加20%-180%（P＜0.05或P＜0.01）。半定量RT-PCR结果显示:10、50、100ng/mL IGF-I干预5d OPG/β-actin、RANKL/β-actin比值显著高于0ng/mL组（P＜0.05）;ELISA显示,在1-100ng/mL浓度范围内,IGF-I呈剂量依赖方式上调OPG蛋白表达,其中10、50、100ng/mL干预组与0ng/mL组差异显著（P＜0.05）。提示IGF-I是奶牛成骨细胞增殖、分化以、矿化及重建的代谢促进剂,这可能是IGF-I参与奶牛骨代谢性疾病的重要机制之一。4.IGF-I抑制血清饥饿诱导的奶牛成骨细胞凋亡研究血清饥饿对奶牛成骨细胞凋亡的诱导作用,并探讨IGF-I对血清饥饿诱导的奶牛成骨细胞的影响。结果显示,10-3 M脱氧胸苷存在时,血清饥饿2d,MTT法检测到细胞存活率为50%,经琼脂糖凝胶电泳可见梯形凋亡条带。流式细胞术分析显示,与血清饥饿组相比,100ng/mL IGF-I显著增高奶牛成骨细胞的增殖指数,降低其凋亡率（P＜0.01）。Caspase-3检测结果显示IGF-I显著抑制csspsse-3的活性（P＜0.05）。结果提示血清饥饿可诱导奶牛成骨细胞凋亡,IGF-I抑制这种凋亡诱导作用。