论文部分内容阅读
肝细胞癌是全球发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一,是世界排名第三的癌症杀手,在我国则居第二位。诊断和治疗技术的进步使得肝癌患者的生存率相比上个世纪有了较大提高,但术后高复发率和转移率使肝癌患者的预后难以再上一个台阶,即使作肝移植,转移复发仍然是肝癌面临的首要问题。肝癌的血管侵犯,通常指肉眼癌栓,表现为由癌细胞团块和血栓组成的栓子堵塞门静脉或肝静脉主干,当肉眼癌栓形成后,几乎丧失了手术根治的可能性,术后转移和复发率高,严重影响着患者的预后。如果能在癌栓形成的早期阶段即微血管侵犯阶段,或称微癌栓,形成时就能发现并对其进行积极的干预,阻止其向肉眼癌栓发展,则能提高肝癌的术后生存率,降低复发和转移,明显改善其预后。但微癌栓只能通过手术切除后的标本进行病理学检查而确定,无法在术前明确诊断,因此亟待能够筛查肝癌微血管侵犯的蛋白标记物的出现。蛋白质组学研究主要依赖三大技术,即蛋白质组的制备分离、蛋白质的鉴定和生物信息学技术。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2D-PAGE)以及液相色谱(liquid chromatography, LC)是最主要的分离技术。质谱通过准确测量相对分子质量以及肽指纹谱来鉴定蛋白质和多肽,质谱在鉴定过程中则需要与数据库、计算机网络和应用软件等相配合,应用生物信息学技术分析数量极其庞大的生物信息数据。蛋白质组学用于肝癌的研究主要包括发现新的肿瘤标记物、寻找新的治疗靶点、阐明肿瘤发病机制、提供肿瘤对治疗的反应等信息以指导个体化治疗等。血清作为临床上较易获得的样本包含着极为丰富的信息,能诊断多种疾病的发生和监测机体的总体情况,其中所含的多种蛋白质常常用于临床检验,因此选用血清样本作为寻找肝癌微血管侵犯的标志物拥有极大潜力。然而血清蛋白质组学研究的困难在于其蛋白质组成高度复杂,蛋白质的浓度动态范围超过10个数量级,具有标记物价值的蛋白质往往被高丰度蛋白质所掩盖而不能被发掘。本实验应用安捷伦公司的高丰度蛋白亲和色谱柱(Agilent Human 14 Multiple Affinity Removal System Columns, MARS)去除掉了血清中14种高丰度蛋白质有效地使这一困难得到一定程度的解决。在与液相色谱分离技术配套的各种定量技术中,同位素标记的相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技术以其可同时比较多至8种样品的优势获得广泛应用,该技术以报告离子的丰度来表示蛋白质的相对含量,简化了质谱数据的分析过程；其采用的多种同位素编码的标签标记多肽的氨基端或多肽链赖氨酸残基上的氨基基团,标记效率高,提高了蛋白质组分析的覆盖率和定量的准确性。本课题采用iTRAQ定量技术联合液相色谱串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术,对无血管侵犯、微血管侵犯和肉眼血管侵犯的肝癌患者的血清样本进行比较蛋白质组学研究,寻找与肝癌血管侵犯相关的差异蛋白。鉴定得到75种蛋白质,其中三组样本间的含量差异在20%以上的蛋白34种,由于其中所包含的7种蛋白属于MARS针对的高丰度蛋白,而且在免疫吸附的过程中清除的不彻底可能会使得定量结果发生偏倚,因此我们将另外27种蛋白质认定为差异蛋白。根据生物信息学分析结果了解到这些差异蛋白主要在抗原递呈、细胞运动、碳水化合物代谢、细胞间信号转导和相互作用以及脂质代谢中发挥重要作用。微血管侵犯组与无血管侵犯组相比,12种蛋白表达上调,8种蛋白表达下调；肉眼血管侵犯组与无血管侵犯组相比,8种蛋白表达上调,6种蛋白表达下调。根据一定标准选取了5种蛋白进行Western blot验证,其中血清对氧磷酶1(PON1)的表达情况与iTRAQ结果高度一致,是极有潜力的标记蛋白。用免疫组织化学技术检验了PON1在肝癌组织及癌旁组织的表达情况,发现三组患者肝癌组织中PON1的表达差异与血清一致,癌旁组织表达无统计学差异,且癌旁组织表达高于相应的癌组织。本实验研究表明,PON1作为血清中的一种抗氧化蛋白,可能对肿瘤细胞的转移有重要影响,有希望作为早期诊断肝癌微血管侵犯的血清蛋白质标记物。潜在应用价值应用iTRAQ联合LC-MS/MS技术,是较新的蛋白质组学研究策略之一,并且被证明行之有效,本研究筛查出的一种血清抗氧化蛋白——血清对氧磷酶(PON1)与肝癌血管侵犯具有显著相关性,是潜在的诊断肝癌血管侵犯的标记物和治疗新靶点。创新点本课题首次将肝癌的微血管侵犯的概念从传统的肝癌门静脉癌栓的概念中细分出来加以针对性研究,有利于寻找到能诊断肝癌血管侵犯早期阶段的生物标记物；利用亲和色谱柱去除了血清中的高丰度蛋白质,有效提高了血清中具有潜在标记物价值的蛋白的检出率；利用iTRAQ联合LC-MS/MS技术,克服了以往传统技术上的一些弱点。本研究筛查出一系列与肝癌血管侵犯存在相关性的差异蛋白分子,其中血清对氧磷酶(PON1).与肝癌血管侵犯的相关性得到进一步证明,为探索可用于临床上诊断肝癌血管侵犯的标记物和干预肝癌血管侵犯的新靶点奠定了基础。