前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性恶性肿瘤,近年来在我国的发病率呈快速增加趋势,确诊时多为中晚期、进展性患者[1],其死亡率在亚洲国家中高居第二位,仅次于越南[2]。PCa作为激素依赖性肿瘤,撤激素治疗是中晚期PCa的首选方法,但几乎所有对内分泌治疗敏感的PCa患者约2年左右都会复发,发展为转移性去势抵抗性前列腺癌(metastatic castration resistant prostate cancer,mCRPC),远端转移,死亡率高。目前化疗、放疗、免疫治疗是其主要的治疗手段。以多西他赛(Docetaxel)为基础的化疗,是唯一被证实可适当延长mCRPC患者生存期的药物,但仍有约50%的mCRPC患者对多西他赛不敏感,产生较强的毒性反应,;对多西他赛敏感患者治疗后也易产生多药耐药。目前针对多西他赛耐药前列腺癌,临床严重缺乏有效治疗方案,根据“药泵”蛋白(可将结构完全不同的药物’泵出’细胞而产生耐药)P-gp高表达是多西他赛的耐药机制之一,研发出对P-gp亲和力低的卡巴他赛(cabazitaxel)作为二线治疗药物,而针对其它耐药机制仍无治疗方案。由于肿瘤细胞是无控增殖,而衰老细胞缺乏增殖能力,因此,诱导肿瘤细胞衰老(Prosenescencetherapy)是近年来探索的肿瘤治疗策略[3]。细胞衰老是指细胞增殖到一定阶段后,分裂停止,出现一些独特的改变,如体积增大、胞体变平、细胞周期阻滞,代谢旺盛等,是一种不可逆的生命过程。促肿瘤细胞衰老治疗的优势在于:只需低剂量的药物诱导肿瘤细胞衰老,抑制细胞增殖,对肿瘤起到缓慢控制的作用,显著降低药物的毒副作用,延长生存率等[4,5]。但是,衰老细胞常伴有衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP),SASP由促炎细胞因子、生长因子、趋化因子和基质重塑酶等一系列细胞因子组成,它们通过旁分泌的方式对相邻细胞、微环境产生影响:一方面可募集免疫细胞来清除衰老细胞、发挥抑癌作用;同时,分泌的促炎因子、水解酶也可导致临近组织细胞的增殖、血管新生、侵袭转移等,具有促进肿瘤发展的作用。因此,发挥诱导肿瘤细胞衰老的优势,通过调节衰老细胞的SASP分泌体,降低其促癌作用,对诱导衰老治疗具有重要意义[6-16]。地钱素M(MarchantinM)从苔藓植物中分离得到的新型联苄类天然小分子化合物,本课题组前期研究发现地钱素M具有抗肿瘤活性、抗炎活性,毒性低,是具有研究潜力化合物[17,18]。由于地钱素M具有良好的抗炎活性,我们猜想其是否具有调节衰老细胞的SASP而发挥抗肿瘤作用?在本研究中,我们采用低剂量的地钱素M对肿瘤细胞进行衰老诱导,并分析其对衰老细胞SASP的影响,结果表明1μM地钱素M能显著诱导肿瘤细胞衰老并且减少SASP的分泌,且与多柔比星具有协同增效、降低其毒性的作用。第一部分地钱素M诱导前列腺癌耐药细胞衰老1.地钱素M诱导多种耐药细胞衰老1.1.耐药细胞对地钱素M敏感:前期筛选发现,地钱素M抑制多种肿瘤细胞增殖[17,18],其IC50约10μM。更为重要的是,地钱素M对耐药细胞的IC50值要略低于其敏感细胞,显著抑制耐药细胞的增殖。1.2.低剂量地钱素M诱导耐药细胞衰老:在1μM,2μM地钱素M作用3天后,经多西紫杉醇诱导的前列腺癌多药耐药细胞(PC3/DOC)呈现显著的衰老表型.[19,2.0],包括体积变大、细胞立体性减弱,变扁平;作用5天时,细胞仍维持扁平状态,Edu掺入结果表明细胞增殖停滞,80%以上的细胞其β-半乳糖苷酶染色呈阳性。流式分析发现,PC3/DOC细胞周期阻滞于S期。同时,我们发现地钱素M可诱导多种耐药肿瘤细胞衰老,包括紫杉醇诱导的多药耐药的肺癌细胞H460/RT,顺铂诱导的多药耐药食管癌细胞EC109/CDDP,以及鼠源的前列腺癌多药耐药细胞RM1/DOC,但是对人源非肿瘤前列腺上皮细胞(RWPE1)、人源正常成纤维细胞(NHF),并无显著的抑制作用。2.地钱素M通过抑制蛋白酶体活性,诱导前列腺癌耐药细胞衰老Western Blotting实验结果表明,在1μM地钱素M作用5天后,可引起多药、耐药前列腺癌细胞(PC3/DOC)的DNA损伤。蛋白酶体活性检测结果表明,1μM地钱素M可以抑制蛋白酶体活性。提高蛋白酶体活性与地钱素M连用后,可以逆转PC3/DOC细胞衰老趋势。提示我们地钱素M通过抑制蛋白酶体活性,引起DNA损伤,可以诱导细胞衰老。第二部分地钱素M对衰老细胞SASP的调节作用1.地钱素M减少衰老细胞SASP的分泌1.1.蛋白定量芯片分析结果:为了确定地钱素M是否影响衰老细胞的SASP,我们收集衰老细胞上清进行蛋白定量芯片分析,结果显示地钱素M诱导的衰老细胞,其分泌的SASP中IL-1α,IL-1β,IL6显著低于盐酸多柔比星组,且呈时间依赖性。1.2.RT-PCR分析结果:为进一步分析地钱素M对SASP的调节作用,我们对经药物处理过的前列腺癌耐药细胞PC3/DOC进行定量分析,结果显示,与对照组相比,盐酸多柔比星组中多种炎性因子出现明显的上调(如:IL1α,IL1β,IL6等),而经地钱素M处理过的样品则变化不明显。以上结果与芯片数据一致。2.地钱素M降低衰老细胞的SASP的促增殖作用:我们取衰老细胞的上清,按不同比例加至前列腺癌细胞PC3和正常前列腺上皮细胞RWPE1中,作用24小时后,分析细胞的增殖情况。MTT结果提示地钱素M诱导细胞衰老后产生的细胞上清不会促进癌细胞增殖。而盐酸多柔比星组的上清却可明显促进细胞增殖。3.地钱素 M 减少转录因子 EB(transcription factor EB,TFEB)、transcription factor E3(TFE3),p65 的入核3.1由于NF-kB、TFEB、TFE3都是调节SASP的重要转录因子[21,22],所以我们首先分析地钱素M是否通过这些转录因子调节SASP的表达。Western blotting和免疫荧光实验结果表明地钱素M可以显著抑制PC3/DOC细胞中TFEB,TFE3,p-p65的表达水平,且呈时间依赖性;通过提取核蛋白的发现,地钱素M还可抑制PC3/DOC细胞中经饥饿、内质网应激诱导剂(Thapsigargin,TG)刺激后的 TFEB 入核。3.2地钱素M抑制炎性小体NLRP3活性。ELISA实验结果表明地钱素M不仅可以抑制炎性因子IL1β的表达,而且可以针对PC3/DOC细胞中p65过表达引起的IL1β上调发挥显著的抑制作用。Western blotting实验结果表明,地钱素M可以抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase1的剪切激活,从而抑制IL1β前体pro-IL 1β剪切成成熟的IL1β。由此证明,地钱素M可以抑制炎性小体NLRP3活性。第三部分地钱素M与盐酸多柔比星具有协同增效作用1.地钱素M与盐酸多柔比星具有协同增效作用:通过药物联合作用分析发现,地钱素M与盐酸多柔比星具有协同作用。2.低剂量的地钱素M可以降低盐酸多柔比星的副作用:Western blotting实验结果表明,地钱素M可以针对由盐酸多柔比星刺激引起的IL1β发挥显著的抑制作用。RT-PCR的结果显示,低剂量的地钱素M可以逆转盐酸多柔比星引起的多种炎性因子的分泌。第四部分结论及创新点1.结论1.1.前列腺癌多药耐药细胞对多西他赛、多柔比星等均产生耐受,但对双联苄类化合物地钱素M有良好应答,略优于敏感细胞,表明地钱素M具有逆转耐药的潜能。1.2.低剂量的地钱素M可非常显著的诱导前列腺癌耐药细胞衰老,且对其他药物诱导的耐药细胞,包括紫杉醇诱导的的肺癌耐药细胞、顺铂诱导的食管癌耐药细胞以及鼠源的前列腺癌耐药细胞均有良好的促衰老活性。1.3.低剂量的地钱素M阻滞前列腺癌耐药细胞于S期,诱导DNA损伤,且p21信号在诱导衰老过程中发挥重要作用,而p16和p27的作用不显著。1.4.低剂量的地钱素M抑制蛋白酶体活性,进而诱导DNA损伤、促进细胞衰老。1.5.和多柔比星诱导的细胞衰老相比,地钱素M诱导的细胞衰老,具有显著降低促炎相关的炎性分泌体的作用,可显著抑制炎性小体NLRP3活性,抑制衰老相关分泌表型,同时降低SASP对正常细胞、其它肿瘤细胞的增殖作用。1.6.地钱素M通过抑制转录因子TFEB、TFE3、phosphor-p65的活化入核从而调节促炎因子的表达和分泌。特别是抑制NLRP3、显著下调IL1β的成熟和分泌。1.7.地钱素M与盐酸多柔比星具有协同增效作用,显著降低多柔比星的毒性,增加耐药细胞对其敏感性。2.创新点与不足之处2.1首次报道前列腺癌耐药细胞对地钱素M敏感,且低剂量地钱素M诱导耐药细胞周期阻滞、DNA损伤、细胞衰老。但该化合物诱导衰老的机制尚需进一步分析。2.2首次报道地钱素M的抗炎活性可能与抑制转录因子TFEB、TFE3以及NF-κB的活化有关。虽然地钱素M可靶向蛋白酶体,但准确的作用靶标尚需通过合成带有tag的地钱素M进行组学分析鉴定,并确定抑制蛋白酶体活性与抑制促炎转录因子之间的关联。