钾离子在植物的信号传导,生物胁迫等很多生理功能中发挥了很重要的作用。对钾离子吸收,特别是钾离子通道门控机制的了解,可以为农作物相关性状研究奠定基础,也为缓解未来可能出现的粮食短缺提供一条可行的思路。SNARE（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感附着蛋白受体）蛋白通过形成SNARE复合物完成植物膜运输的最终膜融合步骤。除了膜融合中的作用外,SNARE蛋白还从亚细胞定位及通道门控活性等层面调节离子通道的功能。拟南芥SNARE蛋白SYP121和VAMP721都能与电压门控钾离子通道相互作用,前者影响钾离子通道的亚细胞定位并通过蛋白互作直接促进其通道活性,而后者则抑制通道活性。蛋白互作是生物体生理活动基础,因此,检测蛋白质-蛋白质相互作用对于揭示个体细胞过程背后的调控机制至关重要。常规方法如Pull-Down、荧光能量共振转移、双分子荧光互补法等一般检测一对一互作,不能提供足够的信息来阐明活细胞中的多组分相互作用,而实际上细胞内完成生理活动往往是多个蛋白互作的结果。本实验室前期从基于杂交的酵母分裂泛素化系统出发,构建了Tri-SUS系统,可用于三蛋白互作研究。Tri-SUS系统中,诱饵蛋白和猎物蛋白通过组成型启动子p TDH3控制,而第三蛋白由pmet25启动子控制受甲硫氨酸浓度负向调控,这一改进实现了三蛋白互作。但由于蛋白水平对酵母实验结果的影响,是否改变启动子强度会影响蛋白互作检测结果值得探究。因此,本研究在原有Tri-SUS体系中进行了启动子的优化,选取另外两种组成型启动子p CHO1、p CYC1替换p TDH3,以及不同的铁离子浓度负向调控诱导型启动子p FET3替换pmet25,获得Tri-SUSnew系列载体,并用于研究钾离子通道亚基KC1与VAMP721/SYP121的互作关系。对Tri-SUS系统的改进,也将为生物学研究提供一个强有力的研究工具。更换诱饵蛋白启动子表明,在相对弱启动子调控下,减弱诱饵蛋白KC1的表达量后,在SYP121作为第三蛋白介导下,原本与钾通道无法互作的VAMP721Y57D突变体通过实验显示结合。表明更换启动子对于进一步改进Tri-SUS系统有意义而在改变为p FET3启动子调控第三蛋白表达后,SYP121作为猎物蛋白,VAMP721作为第三蛋白,可以看到仅在低浓度铁存在下,酵母微弱生长。对此现象,其中一个解释是p FET3与pmet25启动子本底调控表达作用不同。大量存在的VAMP721竞争性与钾通道互作,影响作为猎物蛋白的SYP121结合,从而抑制酵母生长。