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小麦秆锈病是世界范围内的重要气传性病害之一,其病原为小麦秆锈菌(Puccinia graminis Pers. f. sp. tritici Erikss & E. Henn),该病害发生历史悠久,分布广泛,流行性强,危害严重,曾对小麦生产造成了巨大的损失,严重威胁世界各国的粮食生产安全。在小麦秆锈病长期的防治过程中,培育和种植抗病品种成为防治该病害最基本和经济有效的途径。但品种抗病性丧失则是应用抗病品种过程中非常突出的问题。前人的研究结果表明,小麦秆锈菌新小种的产生和发展是引致小麦抗秆锈性丧失的主要原因。所以,准确、及时地监测小麦秆锈菌生理小种的类型及小种组成的变化对于小麦秆锈病的综合防治及抗病品种的选育具有重要指导意义。小麦秆锈菌为专性寄生菌,在鉴定病菌生理小种和分析毒性时,传统的方法不仅程序复杂、费工费时,而且鉴定条件容易影响结果的准确性。现代分子生物学的迅猛发展,为许多研究提供了新的方法和手段。分子标记技术在区分小麦秆锈菌生理小种方面显示了充分的可行性。因此,本研究利用RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)、AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)和SSR (Simple Sequence Repeat)标记技术对我国小麦秆锈菌主要生理小种(21C3CTH、21C3CPH、21C3CFH、34MKG、34C2MKK、34C2MKR和Ig99)进行遗传分析,筛选主要生理小种的特异性标记,旨在建立起秆锈菌主要生理小种的特异性分子标记系统,为今后可能地该病菌小种或毒力基因的分子鉴定替代鉴别寄主鉴定奠定基础。与此同时,从病害防治应用角度,针对小麦上的三种重要的专性寄生病原：秆锈病菌、叶锈病菌和白粉病菌,开展了三重PCR检测方法研究,为三种病害的单独或混合发生的早期快速检测提供技术支持。具体研究结果如下：1.利用正交试验设计,对PCR体系中的Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、随机引物和模板DNA浓度等主要影响因素进行优化,并在此基础上,对退火温度和循环次数进行了优化。试验结果表明,小麦秆锈菌RAPD扩增的最佳体系为：25 μ.L体系中含1×Buffer, 40 ng模板DNA,1.5mmol·L-1Mg2+,2.0 U TaqDNA聚合酶,0.25 mmol·L-1 dNTPs,0.40 μmol·L-1随机引物；最佳退火温度为36℃,最佳循环次数为43次。2.选用了156条10碱基随机引物对小麦秆锈菌的6个主要生理小种进行RAPD标记分析,其中有121条引物可以得到清晰稳定的扩增图谱,且各生理小种间的多态性比较丰富；RAPD标记分析结果显示,从21C3CTH和21C3CFH两小种中分别筛选出了特异性条带。其中引物S8在21C3CTH中扩增出约1200 bp特异条带；引物S31在21C3CFH中扩增出约1700 bp特异条带；引物S36在21C3CTH中扩增出约1100 bp特异条带；引物S92在21C3CTH中扩增出782 bp特异条带。将特异RAPD片段回收、克隆和测序,设计特异PCR引物,最终将引物S92在21C3CTH扩增得到的RAPD特异标记成功转化为更为稳定的SCAR (Specific Characteristic Amplification Region)标记。3.采用AFLP方法对7个小麦秆锈菌生理小种进行DNA多态性分析,共计筛选了64对引物,其中引物组合E2/M2在21C3CPH中扩增出279 bp特异条带；E7/M7在34MKG中扩增出171 bp特异条带；E4/M6在34C2MKK中扩增出263 bp特异条带；E7/M3在Ug99中扩增出388 bp特异条带。通过对特异条带回收、克隆以及测序,设计出相应的SCAR标记引物,通过对各自单孢菌系及其它供试小种的回检,结果表明,开发的SCAR标记具有一定的特异性。4.通过25对SSR特异性引物对7个小麦秆锈菌主要生理小种单孢菌系的DNA多态性分析,结果显示所有特异引物对秆锈菌的扩增结果均呈现出丰富多态性,秆锈菌的不同生理小种之间存在遗传差异。其中引物SSRI 80在21C3CPH中扩增出205 bp的特异条带；引物SSR6在Ug99中扩增出170 bp的特异条带,经过多次的重复试验,这些特异条带均能够比较稳定地重复出现,说明引物SSR180和引物SSR6可用于小种21C3CPH和Ug99的特异性检测。5.本研究选择了小麦秆锈病菌、小麦叶锈病菌和小麦白粉病菌三种病原菌的特异引物,从退火温度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度以及引物浓度四个方面对PCR反应体系进行了优化,确立了可同时检测小麦秆锈病菌、小麦叶锈病菌和小麦白粉病菌的三重PCR检测体系,并进行了特异性和灵敏度测定。结果表明,该反应体系扩增出的三种病原菌的特异性DNA片段大小分别为395 bp、465 bp和151 bp,且特异性和敏感性良好,能够分别检出1 ng小麦秆锈病菌、10pg小麦叶锈病菌和10pg小麦白粉病菌的DNA。以上研究结果表明,采用正交法优化确立的小麦秆锈菌RAPD扩增体系,一定程度上克服了RAPD方法原有不足且保持了其优点,成为一种理想的扩增体系；筛选得到的小麦秆锈菌多个小种分子标记,为开创中国小麦秆锈菌主要生理小种(或毒力基因)的分子鉴定提供了新的尝试和新的基本方法,具有较强的理论和实践意义；本研究建立了可进行早期诊断小麦秆锈病、小麦叶锈病和小麦白粉病的三重PCR检测技术,可为上述三种病害的准确预测和适时防治提供理论帮助。