论文部分内容阅读
研究背景：人巨细胞病毒(HCMV, human cytomegalovirus)属于疱疹病毒科β亚科,是双链线性DNA病毒。HCMV在人群中感染很普遍,不同国家和不同经济状况的地区CMV感染率不同,在亚洲大约90%的人口被感染,但其中多数为无症状的亚临床感染,备受重视的是先天性感染和器官移植等免疫功能低下人群的感染。先天性HCMV感染可造成胎儿的组织器官的损伤及发育的异常,如造血系统,呼吸系统,神经系统等,是引起婴儿先天性畸形的关键因素之一。目前对HCMV的感染没有合适的治疗和预防措施,所以寻找一种有效的,高灵敏度和特异性的,用于ELISA检测方法的抗原对优生优育及阻止HCMV传播有重要意义。研究目的：表达、纯化一种可溶性的重组CMV抗原,用于检测血清中的CMV抗体IgG,并研究该蛋白的免疫学活性,预测其用于HCMV免疫学检测的可能性,为下一步的应用提供理论依据。研究方法：1.选取HCMV中抗原性较强的pp150蛋白C端(aa595-614, aa1006-1048)和p52蛋白C端(aa202-433)的基因片段的三个抗原表位,人工合成cDNA序列CG3,将此序列构建入原核表达质粒；2.将构建好的原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21-(DE3)中,并在16-C下通过IPTG诱导表达,通过金属螯合层析柱对重组蛋白CG3进行纯化；3.对纯化后的CG3通过western-blotting和ELISA分析其免疫学性质。研究结果：1.成功将人工合成的CG3序列正确构建入原核表达载体中,并转化入大肠杆菌BL21-(DE3)中；2.确定重组蛋白CG3的表达条件(2YT pH7.0、添加诱导剂时菌液OD在0.5-1之间、IPTG浓度为0.5mM、温度为16℃)和可溶性(部分可溶)；3.用阳性和阴性血清做为一抗检测重组抗原CG3的特异性进行鉴定,结果显示其特异性较好；4.经ELISA实验比较重组蛋白CG3与SORIN抗巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒,结果显示重组蛋白的灵敏度68.75%；特异性83.05%；假阳性率31.25%；假阴性率16.95%；符合率86.82%；Kappa值0.52。重组抗原CG3与Sorin试剂检测HCMV-IgG抗体呈中度相关。结论：1.重组抗原CG3具有天然抗巨细胞IgG抗体识别的抗原表位,可以与人抗巨细胞病毒工gG抗体结合；2.将HCMV的ppl50蛋白(UL32基因)和pp52蛋白(UL44基因)的三个表位串联在一起表达,重组抗原具有较强的抗原性；3.融合表达的重组抗原敏感性较差,但是避免了由于杂蛋白干扰造成的特异性降低；4.本研究中所合成的重组抗原对检测抗HCMV特异性抗体Ig-G具有较强的特异性；5.纯化过程较以往报道的方法简单,仅需要过HisTrap柱,便可得到纯度较高的蛋白；6.重组抗原CG3具有一定的应用价值。