论文部分内容阅读
目的探讨过表达野生型第10号染色体缺乏的磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)和其突变体G129E(仅保有蛋白磷酸酶活性而失去脂质磷酸酶活性)对体外培养的活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)骨架蛋白actin及细胞内钙离子浓度的影响。方法研究需要的腺病毒(AD-PTEN,AD-G129E,AD-GFP)应用AD293细胞进行扩增,并测量滴度;体外培养活化的大鼠HSC(HSC-T6细胞系),借助腺病毒将具有双重特异性磷酸酶活性的过表达的野生型PTEN基因和其突变后仅具有蛋白磷酸酶活性的G129E基因转染肝星状细胞;使用Western blot和Real-time PCR检验肝星状细胞的PTEN蛋白和m RNA的表达;借助激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM),采用钙荧光探针Rhod-2/AM负载检测肝星状细胞内钙离子浓度、荧光素四甲基异硫氰酸罗丹明(Tetramethylrhodamine isothiocyanate,TRITC)标记的鬼笔环肽检测HSC的形态、F-actin的分布及荧光强度、伪足以及应力纤维的变化。全部研究内容都使用Excel 2003建立资料库,统计学分析使用SPSS 17.0统计软件,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间比较采用LSD检验,P<0.05即认为有统计学意义。研究分4组:1 Control:用只含有8%胎牛血清的高糖培养基培养细胞,在转染步骤用DMEM代替病毒液;2 AD-GFP组:转染表达绿色荧光蛋白(GFP)的对照空病毒AD-GFP;3 AD-PTEN组:将含有过表达的PTEN基因并能合成GFP的重组腺病毒AD-PTEN转染HSC;4 AD-G129E组:将含有G129E基因并能合成GFP的重组腺病毒AD-G129E转染HSC。结果1通过腺病毒反复感染人胚肾细胞(AD293)的方法扩增实验所需的腺病毒,Ad-PTEN滴度为1.3×109pfu/m L、Ad-G129E滴度为1.4×109pfu/m L及Ad-GFP滴度为1.6×109pfu/m L。2 M.O.I.值100时,腺病毒转染HSC后48h,计数GFP荧光阳性表达细胞,测得AD-GFP、AD-PTEN及AD-G129E各组腺病毒转染率均>80%。3腺病毒转染后48h,应用Western blot方法检验每组HSC的PTEN蛋白显示:AD-PTEN组(1.08±0.07)、AD-G129E组(0.97±0.04)明显高于Control(0.56±0.05)及AD-GFP(0.69±0.07),差异有统计学意义(P<0.05);而Control与AD-GFP组和AD-PTEN组与AD-G129E组之间都没有明显差别(P>0.05)。使用Real-time PCR方法检验m RNA表达显示:AD-PTEN组(6.11.±0.072)、AD-G129E组(6.167±0.047)明显高于Control(7.043±0.036)及AD-GFP(6.990±0.037),差异有统计学意义(P<0.05);而Control与ADGFP组和AD-PTEN组与AD-G129E组之间都没有明显差别(P>0.05)。4TRITC标记的鬼笔环肽检测显示:Control组与AD-GFP组HSC多呈星形或多边体形,F-actin重构形成大量粗大的应力纤维,横跨于整个细胞内,细胞周围可见层状伪足;AD-PTEN组及AD-G129E组HSC多为梭形,F-actin主要分布于细胞周边,细胞内可见少量纤细的应力纤维,细胞周边层状伪足消失;F-actin的荧光强度AD-PTEN组(357.67±13.39)、AD-G129E组(377.25±14.55)明显低于Control组(961.87±27.33)及AD-GFP组(954.68±20.71),P<0.05,而ADPTEN组与AD-G129E组以及Control组与AD-GFP组之间没有明显差别,P>0.05。5钙荧光探针Rhod-2/AM检测HSC内钙离子浓度显示:AD-PTEN组(251.60±90.88)及AD-G129E组(352.18±146.01)明显低于Control组(1953.95±132.99)及Ad-GFP组(1937.57±115.17),P<0.05,而AD-PTEN组与AD-G129E组以及Control组与AD-GFP组之间没有明显差别,P>0.05。结论1野生型PTEN过表达可明显抑制体外活化肝星状细胞骨架蛋白actin的形成及细胞骨架的重构。2野生型PTEN过表达可显著降低肝星状细胞内钙离子浓度。3 PTEN丧失脂质磷酸酶活性的突变对活化肝星状细胞骨架蛋白actin及细胞内钙离子浓度无影响。4 PTEN通过其蛋白磷酸酶活性发挥其抑制活化肝星状细胞骨架蛋白actin的形成及降低细胞内钙离子浓度的作用。