B淋巴细胞刺激因子(BAFF)和T细胞上可诱导表达的、与HSV的糖蛋白D竞争结合HVEM的淋巴毒素类似物(LIGHT)都是TNF超家族的重要成员。BAFF广泛参与B淋巴细胞的生长、发育和分化,LIGHT能够刺激T淋巴细胞的增生、诱导和调节肿瘤细胞凋亡等功能,二者在淋巴器官的发生、自身免疫病、抗病毒免疫等均发挥重要作用。到目前为止,对于石斑鱼BAFF基因和斑马鱼LIGHT基因的研究在国内外还处于空白状态。1、青石斑鱼B淋巴细胞刺激因子的克隆、表达及其生物活性的研究。本实验通过RT-PCR和RACE技术,从青石斑鱼脾脏组织中扩增得到B淋巴细胞因子(EaBAFF)的全长cDNA序列,该基因全长1442bp,包括5’和3’端非编码区以及780bp的开放阅读框(编码259个氨基酸)。与其它物种已知BAFF特征相同,EaBAFF的氨基酸序列也含有一个预测跨膜区、潜在的弗林酶切位点、三个半胱氨酸残基、一个典型的TNF结构域。预测的三维结构与人的三维结构极其相似。实时定量PCR表明EaBAFF主要表达在青石斑鱼脾脏中。pET28a-EasBAFF质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了His6-EasBAFF融合蛋白,对镍柱纯化得到的融合蛋白进行SDS-PAGE和western blot分析鉴定。激光共聚焦结果显示该蛋白可以与青石斑鱼和小鼠的淋巴细胞表面的受体结合,体外WST-8检测表明His6-EasBAFF能够促进青石斑鱼淋巴细胞和小鼠B淋巴细胞的存活。我们的研究结果或许能够为青石斑鱼免疫系统的研究提供理论依据,EasBAFF有可能作为免疫增强剂增强鱼体抵抗力。2、斑马鱼LIGHT的克隆、表达及活性分析。应用RT-PCR技术,从斑马鱼脾脏组织中扩增的到LIGHT的全长CDS序列,zLIGHT的开放阅读框为708bp,编码235个氨基酸。zLIGHT含有预测跨膜区以及典型的胞外TNF结构域。实时定量PCR表明zLIGHT主要表达在斑马鱼脾脏和肾脏,pSUMO-zsLIGHT质粒能够在大肠杆菌BL21(DE3)中高效可溶表达,系统进化树分析显示斑马鱼在进化地位上属于鱼类分支,SDS-PAGE和Western blot分析进一步鉴定了该蛋白。激光共聚焦结果显示该蛋白可以结合到T淋巴细胞表面。斑马鱼有可能成为进一步研究LIGHT基因的模式动物。