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结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是消化道常见的恶性肿瘤之一。据报道,结直肠癌约占全球癌症及其相关死亡的10%,结直肠癌是在女性中第二大常见,男性中第三大常见的癌症。早期诊断及治疗可明显提高结直肠癌患者的生存率,但现有已知的肿瘤标记物普遍敏感性较低,无法满足早期预测肿瘤的需求。寻找敏感性高的肿瘤标记物是目前亟待解决的问题。目的:本研究旨在应用蛋白质组学技术,对结直肠癌患者的肿瘤组织和癌旁组织进行蛋白质组学分析鉴定并筛选出差异表达蛋白,从中挑选结直肠癌潜在的肿瘤标记物,进行进一步验证以及临床大样本实验,从而判断其临床应用价值。方法:1.采用纳升级液相色谱串联质谱分析（Nano-LC-MS/MS）为基础的鸟枪法蛋白质组学技术对71例结直肠癌病理标本进行蛋白质组学分析,使用Uniprot数据库检索鉴定,并筛选差异表达蛋白。2.对结直肠癌差异表达蛋白进行GO、KEGG、PPI等生物信息学分析。3.应用Western blot验证部分差异蛋白在结直肠癌组织中的表达情况。4.联合转录组学和蛋白质组学数据库,分析筛选ANXA4、PLOD3和SERPINH1作为结直肠癌潜在的肿瘤标记物,进行后续研究。5.应用RT-qPCR检测ANXA4、PLOD3和SERPINH1在结直肠癌组织中mRNA水平的表达情况。6.通过HPA数据库和免疫组化染色实验检测ANXA4、PLOD3和SERPINH1在结直肠癌组织中的表达情况和亚细胞定位,并统计分析蛋白表达与临床病理参数之间的相关性。7.应用Western blot和RT-qPCR检测ANXA4、PLOD3和SERPINH1在结直肠癌细胞系中蛋白和mRNA水平的表达情况。8.采用ELISA方法检测ANXA4、PLOD3和SERPINH1的自身抗体在246例结直肠癌患者和100例健康体检人群的外周血中表达水平,进行临床大样本实验,判断其临床应用价值。结果:1.在结直肠癌的蛋白质组学研究中,总共鉴定出2969种蛋白质,按照差异表达倍数和显著性差异分析的原则,从中筛选43个结直肠癌差异表达蛋白,其中包括PLOD3,S100A11,SERPINH1,HUWE1,ANXA4,PADI2,CTSL,CTSZ,PTPN6等。2.生物信息学分析结果显示:在细胞组分上（GO-CC）,差异表达蛋白大部分位于高尔基囊泡、运输囊泡、包被囊泡、含有胶原蛋白的细胞外基质等;在分子功能上（GO-MF）,差异表达蛋白以结合功能和催化活性为主,具有磷脂结合、蛋白聚糖结合、酰胺结合、硫化合物结合、肽结合等;在生物学过程上（GO-BP）,差异表达蛋白主要参与抗原加工、外源性肽抗原的呈递、中性粒细胞脱颗粒、活化、高尔基囊泡转运等。KEGG分析显示,差异表达蛋白参与吞噬体、溶酶体、抗原加工和呈递、内质网中的蛋白质加工、细胞粘附、细胞凋亡等信号通路。PPI分析结果显示,差异表达蛋白之间相互作用比较紧密,形成一个复杂的蛋白互作网络,差异表达蛋白之间有HLA-DQA1、HLA-DRB1、SEC24C、SEC24D在内的关键节点。3.Western blot结果显示,表达上调蛋白SERPINB5、SERPINH1、PLOD3、ANXA4和表达下调蛋白PADI2、CTSZ在结直肠癌的肿瘤组织和癌旁组织中表达存在显著差异（P＜0.05）,验证了蛋白质组学分析结果的可靠性。4.从结直肠癌差异表达蛋白的生物信息学分析结果中选择一个GO集合,即GO:0062023（含胶原蛋白的细胞外基质）,通过TCGA数据库和CPTAC数据库联合分析,筛选其中ANXA4、PLOD3和SERPINH1作为结直肠癌潜在的肿瘤标记物,进行后续研究。5.RT-qPCR结果显示,与癌旁组织相比,ANXA4、PLOD3和SERPINH1在结直肠癌的肿瘤组织中mRNA的表达显著升高（P＜0.05）。6.HPA数据库和免疫组化染色实验结果显示,与正常肠上皮细胞相比,ANXA4、PLOD3和SERPINH1在结直肠癌肿瘤组织中表达明显升高,阳性表达部位为肿瘤细胞的细胞浆。7.ANXA4、SERPINH1蛋白表达与TNM分期、淋巴结转移之间具有显著相关（P＜0.05）;PLOD3蛋白表达与病理类型、TNM分期、淋巴结转移之间具有显著相关（P＜0.05）。8.与NCM460相比,ANXA4、PLOD3和SERPINH1在大部分结直肠癌细胞系如Lo Vo、HCT116中mRNA表达显著升高（P＜0.05）。9.与NCM460相比,ANXA4、PLOD3和SERPINH1在大部分结直肠癌细胞系如SW620、HCT116中蛋白表达显著升高（P＜0.05）。10.ELISA实验结果显示:1)早期结直肠癌组和晚期结直肠癌组与健康对照组相比,ANXA4自身抗体水平均显著升高（P＜0.001;P＜0.001）,并且晚期结直肠癌组显著高于早期结直肠癌组（P=0.0349）。结直肠癌化疗组ANXA4自身抗体水平显著低于健康对照组（P=0.0204）。2)早期结直肠癌组PLOD3自身抗体水平显著高于健康对照组（P＜0.0001）。3)早期结直肠癌组SERPINH1自身抗体水平低于健康对照组,但差异无统计学意义（P=0.3552）。结论:1.本研究通过蛋白质组学技术获得了结直肠癌组织与癌旁组织的差异表达蛋白谱。2.ANXA4、PLOD3和SERPINH1在结直肠癌中显著性差异表达,并且与TNM分期、淋巴结转移之间具有显著相关,可以作为结直肠癌候选肿瘤标记物。3.ANXA4、PLOD3的自身抗体水平在早期结直肠癌中显著升高,可以作为早期结直肠癌的候选肿瘤标记物。4.ANXA4自身抗体水平随着肿瘤分期的进展（从早期到晚期）而显著升高,可以反映结直肠癌的进展情况;ANXA4自身抗体还能反映接受铂类药物化疗的结直肠癌患者的预后,具有一定的临床应用价值。