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心血管疾病是导致我国居民死亡的主要原因。其中,心肌缺血是我国心血管疾病最主要的病种。尽管临床上采用冠状动脉介入、静脉溶栓等治疗方法大大减轻了缺血造成的心肌缺血损伤,但当患者恢复血液灌注却可能造成高于缺血本身带来的损伤——心肌缺血/再灌注（Myocardial ischemia/reperfusion,MI/R）损伤,从而制约了冠脉再通的治疗效果。因此,临床上迫切需要寻找高效、靶向的药物进行及时的干预。Neddylation是一类新型蛋白质翻译后修饰,可将类泛素样蛋白NEDD8（Neural-precursor-cell expressed developmentally down regulated 8,NEDD8）与靶蛋白结合,进而通过影响底物蛋白的构象、稳定性、功能来调控多种细胞过程。近年来,在心血管系统中NEDD8的作用备受关注。MLN4924是一种选择性NEDD8激活酶（NAE）抑制剂,能够与NEDD8形成不可逆的共价化合物来特异性抑制E1,进而阻止NAE中UBA3与NEDD8之间形成硫酯键,进而抑制CRL连接酶E3的活性,从而导致底物蛋白的积聚影响疾病的发生发展。细胞自噬是一个高度变化的动态过程,又被称为“自噬流”,包括自噬体的形成和清除两个密不可分的过程。自噬流受阻导致自噬功能的紊乱可加重心血管的损伤。心肌细胞自噬参与多种心脏疾病的发生发展,包括心肌缺血/再灌注损伤、心肌肥厚、高血压及心力衰竭等。值得注意的是,CRL3与肿瘤和神经细胞,尤其是与心肌细胞的自噬调控相关。为此,MLN4924可能通过调控心肌细胞自噬流受阻改善MI/R状态下心肌细胞的存活和心室功能。本课题将通过病理生理学、分子生物学等分析方法从体内体外两个方面探究MLN4924对MI/R损伤心肌细胞潜在的保护作用及机制。实验目的:1.明确MLN4924对MI/R损伤的心肌细胞具有保护作用;2.明确MLN4924是否通过增强MI/R心肌细胞自噬流发挥心肌保护作用;3.进一步明确MLN4924是否通过Sirt1增强MI/R心肌细胞自噬流发挥心肌保护作用。实验方法:1.在体外水平建立H9c2心肌细胞损伤模型是采用H2O2诱导损伤,检测MLN4924预处理对H9c2心肌细胞的细胞活力、LDH漏出率以及细胞形态和胞内活性氧的影响,明确MLN4924对心肌细胞的保护作用;通过MTT实验和蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测MLN4924和/或氯喹（自噬溶酶体降解抑制剂）处理的情况下,细胞活力以及自噬流相关蛋白P62、LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达的变化;m RFP-GFP-LC3腺病毒转染心肌细胞并检测MLN4924预处理对细胞内自噬体和自噬溶酶体的影响,初步明确MLN4924的心肌保护作用与改善自噬流相关;通过Western Blot检测MLN4924预处理并行H2O2造模后心肌细胞内Sirt1蛋白表达量的变化,采用热迁移及分子对接实验明确MLN4924与Sirt1蛋白间的作用关系;随后采用Sirt1基因沉默技术处理细胞后预孵育MLN4924并行H2O2造模,检测自噬流相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1、Atg5、LAMP2、Rab7的表达水平以及Cullin底物蛋白Nrf2及其下游蛋白HO-1、NQO1的表达水平。在体外水平阐明MLN4924通过Sirt1改善心肌细胞自噬流受阻发挥心肌保护作用的机制。2.在整体动物水平,小鼠心肌内注射Sirt1反义腺病毒,3天后采用冠状动脉左前降支结扎术（Left anterior descending coronary artery,LAD）建立体内MI/R模型;检测心肌损伤的指标:心电图、心肌梗死面积、超声心动图、血清心肌酶谱及抗氧化物;透射电镜、H&E染色及TUNEL染色检测心肌组织的病理学改变及细胞凋亡情况;Western Blot法检测自噬流相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1、Atg5、Rab7的表达量以及Sirtuins家族成员、Cullin3～NEDD8修饰以及Cullin底物蛋白Nrf2及其下游蛋白HO-1、NQO1的表达。在整体动物水平验证MI/R中MLN4924通过Sirt1增强心肌细胞自噬流发挥心肌保护作用的机制。实验结果:1.体外细胞实验结果证明,MLN4924改善H2O2诱导心肌细胞损伤,显著降低LDH漏出率,提高心肌细胞的生存率,抑制ROS的产生;初步探究发现,MLN4924促进自噬流相关蛋白的表达,LC3Ⅱ/Ⅰ升高、P62降低;而MLN4924与氯喹共处理后,导致自噬体-溶酶体结合受阻,其保护作用则消失;同时,m RFP-GFP-LC3腺病毒也发现MLN4924的保护作用是通过改善心肌细胞自噬流受阻发挥的;进一步的研究发现,MLN4924预处理后行H2O2造模心肌细胞内Sirt1蛋白表达量明显增加且CETSA结果也表明MLN4924在细胞水平与Sirt1结合;Sirt1参与MLN4924对心肌细胞内自噬流相关蛋白的表达的调控,如LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、LAMP2、Rab7表达量均显著上调,P62表达量显著下降;而敲低Sirt1后则逆转上述变化。此外,分子对接也表明MLN4924与Sirt1活性位点结合。2.体内实验结果表明,MLN4924能够减轻心肌细胞的凋亡,减小心肌梗死面积,进而改善MI/R损伤小鼠的心功能;而敲低Sirt1则反之。进一步探究其机制发现,MLN4924显著上调Sirt1的表达而非影响Sirtuins家族其他蛋白表达,进而改善心肌细胞自噬流受阻,减轻心肌损伤,发挥心脏保护作用。实验结论:本实验从体内体外水平首次证明MLN4924可通过Sirt1改善心肌细胞自噬流受阻从而发挥抗心肌缺血/再灌注损伤的心肌保护作用。