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目的:近年来,靶向CD19的CAR T细胞治疗B细胞肿瘤取得了显著疗效,但复杂的肿瘤微环境会导致肿瘤免疫逃逸。PD1/PDL1信号通路在此过程中起到重要作用,可溶性PD1（sPD1）可以与PDL1结合,减少PD1/PDL1信号对CAR T细胞的免疫抑制作用。本课题旨在探究分泌sPD1的CAR T细胞的抗肿瘤效果,为肿瘤的免疫治疗提供一种新思路。方法:1.制备用于转导T细胞和肿瘤细胞系的慢病毒。2.体外功能实验阶段,用流式细胞仪检测慢病毒载体的转导效率和转导后2nd CAR T和2nd-sPD1 CAR T细胞对肿瘤细胞的杀伤情况,用ELISA检测sPD1的分泌以及IFN-γ,TNF-α和IL-2等细胞因子的表达情况。3.构建NALM6-PDL1小鼠模型,回输2nd CAR T和2nd-sPD1 CAR T细胞,用活体成像技术检测小鼠体内肿瘤负荷,完成体内功能检测。4.利用流式细胞仪检测CAR T细胞活化表型相关分子CD25、CD107a,分化表型相关分子CD62L、CD45RA以及抗凋亡分子Bcl2等表达情况,从不同角度分析2nd-sPD1 CAR-T细胞抗肿瘤的机制。5.利用生物能量分析仪检测CAR T细胞糖酵解及氧化磷酸化水平,从代谢的角度分析2nd-sPD1 CAR T细胞功能。6.利用RNA测序检测2nd CAR T和2nd-sPD1 CAR T细胞的差异性基因表达,用生物信息学手段从转录水平进行分析。结果:1.成功制备2nd-sPD1 CAR T细胞,构建表达CD19和/或PDL1的K562,NALM6,786o肿瘤细胞系。2.2nd CAR T和2nd-sPD1 CAR T细胞分别与表达CD19和/或PDL1的肿瘤细胞系共孵育,结果显示共表达CD19和PDL1的肿瘤细胞会引起2nd-sPD1 CAR T的细胞因子,如IFN-γ,TNF-α和IL-2等分泌水平升高,并且2nd-sPD1 CAR T细胞的抗肿瘤能力增强。3.活体成像结果显示,2nd-sPD1CAR T组的NALM6-PDL1小鼠体内肿瘤负荷程度较低,说明2nd-sPD1 CAR T细胞对于肿瘤的抑制效果更强。4.流式细胞检测结果显示,在与肿瘤细胞共孵育后,受到肿瘤特异性抗原CD19刺激,2nd-sPD1 CAR T细胞活化表型相关的CD25和CD107a水平升高;在单独培养第8天和第15天,2nd-sPD1 CAR T组的CD45RA+CD62L+幼稚T细胞和CD62L+中央记忆性T细胞群体总占比（82.7%,88.8%）大于2nd CAR T组（68.9%,69.4%）,抗凋亡分子Bcl2表达水平也高于2nd CAR T组。5.生物能量分析仪显示,与对照组相比,无论是否有肿瘤抗原刺激,2nd-sPD1 CAR T组细胞糖酵解都维持在较低水平,但与肿瘤细胞共孵育后,氧化磷酸化水平升高。6.RNA-seq结果显示,与对照组相比,2nd-sPD1 CAR T细胞与早期记忆T细胞、非耗竭型T细胞以及幼稚T细胞相关的基因表达水平更高,与糖酵解、细胞凋亡等相关基因表达水平较低。结论:1.2nd-sPD1 CAR T细胞只对共表达CD19和PDL1的肿瘤细胞产生阳性结果,推测是sPD1阻断了肿瘤细胞表面PDL1对CAR T细胞功能的抑制,从而增强对肿瘤细胞的杀伤作用。2.对接种NALM6-PDL1肿瘤细胞的小鼠模型肿瘤控制作用更好,说明了2nd-sPD1 CAR T细胞在体内复杂的情况下也增强对肿瘤细胞的控制。3.单独培养时,2nd-sPD1 CAR T组幼稚T细胞和中央记忆性T细胞比重较大,Bcl2分子表达水平较高,说明2nd-sPD1 CAR T细胞分泌的sPD1对维持细胞的“干”性和抵抗PDL1引起的凋亡有帮助。受到CD19刺激后,2nd-sPD1 CAR T细胞组的CD25和CD107a表达水平较2nd CAR T组更高,说明sPD1对CAR T细胞的预活化强度也有提高作用。4.细胞能量代谢分析中2nd-sPD1 CAR T细胞较低的糖酵解水平与受到肿瘤抗原刺激后较高的氧化磷酸化水平,验证了2nd-sPD1CAR T细胞具有更好的“干”性。5.在转录水平对2nd-sPD1 CAR T细胞的RNA测序结果与细胞功能检测结果相互印证。利用CAR T细胞分泌可溶性PD1为今后肿瘤的免疫治疗研究提供了一种新思路。