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肠道是食物消化、吸收的重要场所,同时又是最大的免疫器官,对维持动物的生长发育及健康具有重要作用。mi RNA是参与动植物生理和病理过程基因的重要负调控因子,最近的研究表明mi RNA能跨界调控不同物种间基因表达,然而是否能调节动物的肠道发育还未见报道。本研究以玉米mi RNA为代表,对植物mi RNA对肠道细胞增殖的调控作用及其分子机制进行探究。试验一,为了检测植物mi RNA在小鼠肠道的吸收及对肠道的影响,用玉米淀粉代替玉米配制成淀粉饲料,和正常的玉米饲料分别饲喂21日龄小鼠30天。荧光定量PCR检测饲料7个玉米高表达mi RNA,结果显示淀粉饲料中玉米mi RNA水平减少;northern blot、PCR、荧光定量PCR和原位杂交结果显示饲喂玉米饲料组小鼠十二指肠组织能检测到MIR156a-5p;同时饲喂玉米饲料小鼠体重和小肠重量显著降低,且HE统计结果显示绒毛高度与隐窝深度的比值显著降低,荧光定量结果显示肠道上皮特异基因Cdx2 m RNA水平显著下调,表明玉米mi RNAs可能调节肠道上皮增殖。对7个玉米高表mi RNAs进行生物信息学分析,结果显示参与Wnt/β-catenin信号通路调节的有MIR156a-5p和MIR167e-5p,采用荧光定量PCR和western blot方法检测Wnt/β-catenin通路相关基因表达,结果显示通路上游基因Wnt10b、通路关键基因β-catenin、靶基因c-Myc和cyclin D1 m RNA和蛋白水平均显著下调,表明玉米mi RNAs可以被小鼠小肠收,可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活性抑制肠道细胞增殖。试验二,为了验证植物mi RNAs对肠道细胞增殖的影响,通过合成MIR156a-5p和MIR167e-5p mimics转染IPEC-J2细胞后检测细胞数、DNA复制能力和增殖基因PCNA m RNA水平。用不同浓度转染IPEC-J2细胞,细胞计数结果显示,10 pmol时能显著抑制细胞增殖,且有剂量依赖效应;分别在0、24、48和72 h检测抑制效果,且在24 h时抑制效果最明显。Ed U参入法结果显示mimics组DNA复制能力明显受到抑制,荧光定量PCR结果显示mimics组PCNA m RNA水平显著下调。结果表明MIR156a-5p和MIR167e-5p可以抑制肠道上皮细胞增殖。试验三,为了探究MIR156a-5p和MIR167e-5p抑制肠道上皮细胞增殖的机制,通过荧光素酶进行靶基因分别验证它们与Wnt10b和β-catenin的靶关系,结果证明MIR156a-5p能靶向Wnt10b的3’UTR,MIR167e-5p能靶向β-catenin的3’UTR。其次用MIR156a-5p和MIR167e-5p mimics转染IPEC-J2细胞,采用荧光定量PCR和western blot方法检测相关基因水平,结果显示MIR156a-5p可显著抑制IPEC-J2细胞Wnt10b和β-catenin m RNA和蛋白表达水平,同时33位点丝氨酸残基磷酸化的β-catenin蛋白水平显著上调,Wnt信号通路靶基因c-Myc和cyclin D1的m RNA和蛋白水平也显著下调,同时加入它的抑制剂inhibitor能恢复c-Myc和cyclin D1表达;MIR167e-5p能显著抑制β-catenin m RNA和蛋白表达,进而抑制下游c-Myc和cyclin D1表达,同时加入其抑制剂inhibitor能恢复β-catenin、c-Myc和cyclin D1表达。结果表明MIR156a-5p和MIR167e-5p能抑制Wnt/β-catenin信号通路活性,进而抑制细胞增殖。试验四,为了进一步确定植物mi RNAs对Wnt/β-catenin信号通路的调节,使用Wnt信号通路的激活剂Li Cl与MIR156a-5p共同处理肠道上皮细胞IPEC-J2,计算细胞数,且采用荧光的定量PCR、western blot和细胞免疫荧光检测相关基因表达。结果显示MIR156a-5p对抑细胞数量和PCNA m RNA的抑制作用可被Li Cl缓解,表明MIR156a-5p抑制增殖作用得到缓解;同时Li Cl能恢复MIR156a-5p对β-catenin蛋白的抑制,上调cyclin D1的m RNA水平,表明MIR156a-5p对Wnt/β-catenin信号通路的抑制能被Li Cl解除,恢复细胞增殖,进一步确定了MIR156a-5p对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用。试验五,为了在活体直接证明植物mi RNA能被肠道吸收并发挥调节作用,通过给21日龄小鼠灌服成熟单链MIR156a-5p（300 pmol/d）,灌服7天,计算采食量的和体重,并检测小鼠十二指肠MIR156a-5p的吸收和相关基因水平。Northern blot结果显示灌服MIR156a-5p小鼠中MIR156a-5p呈阳性,荧光定量PCR结果也显示十二指肠组织MIR156a-5p水平明显提高,双荧光原位杂交结果显示MIR156a-5p富集于肠道隐窝,与Wnt10b m RNA结合并降低其荧光强度,表明MIR156a-5p可以结合Wnt10b m RNA降低其表达。灌服MIR156a-5p能抑制Cdx2表达,表明肠道上皮细胞受到抑制;同时Wnt10b、β-catenin和cyclin D1 m RNA和蛋白表达量均下调,表明Wnt/β-catenin信号通路活性受到抑制。在活体水平证实了MIR156a-5p能抑制Wnt/β-catenin通路活性,抑制肠道上皮细胞增殖。综上所述,本研究在细胞水平证明MIR156a-5p和MIR167e-5p能抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制肠道上皮细胞增殖;在活体水平证明MIR156a-5p可以被肠道吸收,抑制Wnt/β-catenin通路活性,进而影响肠道发育。研究结果表明植物mi RNA能被肠道吸收并抑制肠道上皮细胞增殖,可能是饲料一种新的功能成分。