【摘 要】
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START(The Steroidogenic Acute Regulatory Protein-related Lipid Transfer)结构域,由220个左右的氨基酸组成,广泛存在于动物、植物、微生物中,且比较保守。动物中,START结构域异常会导致脂质和葡萄糖代谢改变,发生先天性类脂性肾上腺增生、肝癌等疾病,因此其在调控动物发育过程中的功能和作用机制成为研究热点。植物中也广泛存在STAR
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START(The Steroidogenic Acute Regulatory Protein-related Lipid Transfer)结构域,由220个左右的氨基酸组成,广泛存在于动物、植物、微生物中,且比较保守。动物中,START结构域异常会导致脂质和葡萄糖代谢改变,发生先天性类脂性肾上腺增生、肝癌等疾病,因此其在调控动物发育过程中的功能和作用机制成为研究热点。植物中也广泛存在START结构域家族成员,但以START结构域作为对象的研究极少。拟南芥中存在35个含START结构域的蛋白质,分仅含START结构域亚家族和多结构域亚家族,少数几个多结构域亚家族成员因含其它结构域因而其功能得以被研究(如HD-ZLZ或HD-ZIP转录因子家族成员中有的含有START结构域),但仅含START结构域亚家族及START结构域在调控植物生长发育中的功能尚不明确。本研究以拟南芥START结构域亚家族为研究对象,通过生物信息学分析,对其序列同源性、理化性质、启动子作用元件及START结构域组成进行了分析;在生物信息学分析基础上,通过qRT-PCR技术,对仅含START结构域亚家族成员在拟南芥发育不同时期和不同组织表达特性进行了分析。通过对仅含START结构域亚家族成员功能获得和缺失转基因植株进行表型分析,确定其在调控植物叶片极性生长、花发育、种子发育过程中具有重要的功能;用qRT-PCR技术分析仅含START结构域亚家族成员功能获得和突变体植株中仅含START结构域亚家族成员的表达量,阐明了仅含START结构域亚家族成员之间的调控关系;通过分析仅含START结构域亚家族功能获得和缺失突变体及野生型对照中蛋白质、糖和脂肪酸的含量,阐释START结构域对蛋白质、糖、脂肪酸代谢的影响。结果如下:1.生物信息学分析表明:拟南芥START结构域家族共有35个成员,仅含START结构域亚家族9个成员,分别命名为(PCST1-PCST9),但在进化树分析中PCST7和PCST8与其余6个成员不在同一分枝中,且其疏水性结合位点不同。仅含START结构域亚家族仅有PCST3不稳定系数小于40,多数成员均为不稳定蛋白质。基因表达谱分析表明其在根、茎、叶、花和果实中均有表达,但表现出非常明显的器官特异性。2.对仅含START结构域亚家族各成员的功能获得和缺失的转基因植株的表型观察发现:亚家族成员的过表达转基因拟南芥和T-DNA插入突变体的种子均出现明显的大小分化现象,大种子大小与野生型相似,但小种子体积为野生型种子体积的60%以下。选取与野生型大小相似的大种子进行后续表型观察。(1)仅含START结构域亚家族成员过表达后与野生型大小相似的种子均能萌发,但两片子叶向下卷曲,第1对真叶发育时期出现明显的变化:野生型2片真叶完全展开,但过表达仅含START结构域成员的转基因拟南芥仅生长出1片真叶,另1片真叶迟迟不能发育,亚家族各成员过表达植株不对称发育程度不同。T-DNA插入突变体对称性也发生改变,但不如过表达转基因植株的表型严重。(2)仅含START结构域亚家族各成员过表达后,花器官对称性改变,四强雄蕊特征不再明显。野生型拟南芥花器官中有6个花丝,但过表达仅含START结构域亚家族成员后,花丝数量减少(4-5个)。花粉活力下降。T-DNA插入突变体花粉活力也表现下降。(3)仅含START结构域亚家族各成员过表达后,种子发育受到明显影响:果荚内种子出现大小分化,部分种子发育异常。T-DNA插入突变体种子也发生大小分化和部分种子发育异常的现象。说明仅含START结构域亚家族成员表达发生改变均会对种子发育产生明显的影响。3.对种子内部储藏蛋白、可溶性糖和脂肪酸的代谢水平进行分析,发现各成员过表达和T-DNA插入突变体中可溶性糖含量显著增多;过表达植株种子储藏蛋白含量略微升高,各成员过表达种子脂肪酸含量出现显著下降,突变体种子储藏蛋白含量变化不明显,脂肪酸含量略微下降。进一步对脂肪酸各组分含量分析发现,START结构域成员表达量的改变会影响初级脂肪酸向不饱和脂肪酸或长链脂肪酸合成的过程。说明仅含START结构域亚家族成员对种子内部贮藏物质代谢有重要作用。4.利用qRT-PCR技术对仅含START结构域家族各成员过表达和T-DNA插入突变体中其它成员的表达量分析表明,任一成员表达量的变化均会调控其它成员的表达量。5.激素对仅含START结构域亚家族成员表达的调控。该亚家族各成员在IAA、GA、BR和ABA 4种激素处理0.5 h后,与CK相比,各成员表达量出现明显差异,不同处理下不同成员表达量并不一致。
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