1、CRISPR/Cas13系统的安全性研究CRISPR/Cas13系统是一种RNA引导的靶向切割RNA的系统,由Cas13和cr RNA（CRISPR RNA）组成。Cas13具有两种不同的RNase（ribonuclease）活性,其中一种RNase活性负责将pre-cr RNA（precursor cr RNA）加工处理为成熟的cr RNA;另一种RNase活性在Cas13-cr RNA复合物结合目标RNA时被激活,其不仅能顺式（in cis）切割目标RNA,还会反式（in trans）非特异性切割其附近的RNA。这种由目标RNA结合而触发的反式切割活性被称为旁切活性（collateral activity）。虽然Cas13在体外实验和细菌中表现出明显的旁切活性,但是起初将其用于哺乳动物细胞中时并没有检测到其旁切活性。因此,CRISPR/Cas13系统被广泛应用于各种哺乳动物细胞以及小鼠中,具有极大的临床应用潜力,然而,关于该系统在哺乳动物细胞中是否具有旁切活性仍存在争议。在本文中,我们意外地发现利用Rfx Cas13d在成年小鼠脑神经中敲低靶标基因时会导致小鼠死亡。通过动物实验,我们排除了靶标基因功能缺失或脱靶效应导致小鼠死亡的可能性,并且发现只有靶标基因存在且被明显敲低时才会出现死亡,这让我们联想到Cas13的旁切活性。随后,我们证明Rfx Cas13d在哺乳动物细胞中存在旁切活性,且与靶标基因的RNA丰度成正相关,其旁切活性会将28s r RNA切割成两段,导致翻译受损以及ZAKα-JNK/p38-immediate early gene（IEG）通路的活化。综上所述,我们发现应用CRISPR/Cas13系统于小鼠中枢神经系统时会导致小鼠死亡,这对于CRIPSR/Cas13系统的安全性提出了挑战,警示研究人员要重新仔细地评估该系统的安全性,并且要重新审视之前利用该系统所得到的实验结论。此外,我们在Rfx Cas13d旁切活性机制上的探索,一方面可以指导未来对于Cas13的优化,通过降低或消除Cas13的旁切活性,使其成为更加完美的RNA敲低技术;另一方面也可以启发大家利用哺乳动物细胞中Cas13的旁切活性,开发出新的应用。2、基于CRISPR/Cas13系统的技术开发RNA和蛋白质是细胞内关联密切的生物大分子,两者可以通过物理相互作用影响彼此的生命周期和功能。异常的RNA-蛋白质相互作用会导致细胞功能障碍以及疾病发生。因此,研究RNA-蛋白质相互作用网络对于了解细胞内的生物学过程以及疾病的发病机制至关重要。目前,以蛋白质为中心研究RNA-蛋白质相互作用的方法已经十分普及且实用,但是简便且可靠的以RNA为中心的研究方法却很少。dCas13（catalytically dead Cas13）是Cas13的酶活缺失突变体,虽然丧失了对于目标RNA的切割能力,但是依然可以在cr RNA的引导下特异性结合目标RNA,实现精准的RNA定位。我们将d Cas13与邻近标记酶（proximity labeling enzyme,PLE）融合在一起,利用d Cas13在cr RNA的引导下结合目标RNA,同时借助PLE在活细胞内标记目标RNA附近的蛋白质,最终被标记的蛋白质可以被富集并通过质谱鉴定出来,从而达到鉴定与目标RNA互作蛋白质的目的,我们将这种方法命名为CBRPP（CRISPRbased RNA proximity proteomics）。通过多次优化,我们利用CBRPP成功地鉴定到了ACTB m RNA和lnc RNA（long noncoding RNA）NORAD的RNA结合蛋白质（RNAbingding proteins,RBPs）。综上所述,我们开发出一种全新的以RNA为中心研究RNA-蛋白质相互作用的体内方法——CBRPP。相较于之前的方法,该方法操作简捷,且无需交联、RNA-蛋白质复合物的体外操作以及提前编辑目标RNA,是对于现有方法的有力补充,为研究人员提供新的方法选择。