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丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类具有多种功能的同源蛋白,该类蛋白酶抑制剂能够与胰蛋白酶、糜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶的活性部位结合,抑制其蛋白水解活性或者阻止蛋白酶原激活生成蛋白酶。这类蛋白酶抑制剂几乎存在于所有生物体中,在血液凝集、补体激活、纤维溶解、炎症反应和肿瘤抑制等生理过程中发挥着重要作用。本实验室利用宏基因组文库技术构建了广西北部湾海洋微生物宏基因组文库,利用直接测序的筛选策略,筛选得到了一个具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的阳性克隆(pGXAG59),其中可能含有一个编码新型丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因,命名为spi1C(GenBank登录号:JF815525)。
应用生物信息学软件对spi1C进行分析得到以下信息:spi1C由642个碱基对组成;目标靶蛋白由214个氨基酸残基组成,分子量约为24227.28Da,理论等电点为4.33;在DNA水平上,与目前GenBank数据库中的其他基因没有明显的相似性和同源性;在氨基酸水平上,该目标蛋白与来自SalinibacterrubberM8中的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白一致性为38%,相似性为59%。
利用PCR定点技术扩增目标ORF,并与表达载体pETBlue-2连接,导入宿主细胞Escherichia.ColiBL21(DE3)pLysS,得到菌株BL21(DE3)pLysS/pGXAG59G。在本研究中以从该菌株中获得的重组表达蛋白Spi1C作为主要研究对象,对其蛋白活性进行了初步研究。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,在28kDa处有明显的表达条带,与预测结果相符。使用镍柱纯化重组蛋白,应用BAEE和ATEE作为生色底物对重组蛋白Spi1C的蛋白活性进行测定。该抑制剂蛋白的最适PH值为7.0~8.0,最适反应温度为25℃,其变性温度为65℃。在最适条件下,Spi1C对于胰蛋白酶的抑制比活为6941U/mg,对于α-糜蛋白酶的抑制比活为3637U/mg。采用Lineweaver-Burk作图法,测得Spi1C对于胰蛋白酶的抑制常数Ki值为1.52×10-8M,Spi1C对于α-糜蛋白酶的抑制常数Ki值为1.79×10-8M;同时在相同酶浓度条件下测得胰蛋白酶的最大抑制比率为83.48%,α-糜蛋白酶的最大抑制比率为92.84%。
通过本研究证明构建未培养微生物宏基因组文库是筛选新型基因的有效方法。根据检索到的信息,国际上目前未见有关来自于未培养微生物的新型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的功能鉴定的研究报道。