强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种以中轴关节慢性炎症为主的自身免疫性疾病,发病机制至今不明。强直性脊柱炎是医学治疗难题之一,现代医学仍缺乏有效的治疗手段。中医中药在治疗AS方面具有一定的特色和优势。我们前期的实验证实了AS成纤维细胞中存在活跃的BMP/Smad信号传导通路,而在补肾活血方药含药血清的干预作用下,AS成纤维细胞BMP/Smad信号传导通路受到抑制,成骨标志基因cbfa-1表达减少,有效的阻断了成纤维细胞向成骨型分化。从细胞分子生物学的角度阐释了补肾活血法治疗AS,可以抑制其成纤维细胞中BMP/Smad信号通路的活化,这可能是补肾活血方药抗AS骨化的分子机制之一。因此,我们推测,补肾活血方药君药淫羊藿主要成分淫羊藿苷是否也同样具有抑制AS成纤维细胞中BMP/Smad信号通路的活化,从而发挥抗AS骨化的作用。本实验以体外培养的人髋关节囊成纤维细胞为研究对象,借助western blotting技术,从蛋白表达层面上观察补肾活血方药君药淫羊藿主要成分淫羊藿苷对AS成纤维细胞BMP/Smad信号通路的影响,探索中药单体淫羊藿苷抗AS骨化的可能分子机制。1实验研究一髋关节囊成纤维细胞系的建立与鉴定目的：建立髋关节囊成纤维细胞系,观察细胞生长状况及形态特征,应用免疫组化法鉴定细胞来源,为下一步实验的顺利进行提供可靠的体外试验模型。方法：在北京大学第三医院骨科关节组的协助下,选取因髋关节骨化融合需行全髋关节置换术的AS患者及因外伤致股骨颈骨折需行全髋关节置换术患者的髋关节囊组织,采用组织块原代培养法建立成纤维细胞系。倒置显微镜观察细胞生长状况及形态特征,免疫组化法鉴定培养细胞的来源。结果：用倒置显微镜观察培养的人髋关节囊成纤维细胞为梭形或多角形,细胞排列紧密,生长状况良好,免疫组化法鉴定后波形丝蛋白呈阳性,角蛋白呈阴性。结论：成功的建立了人髋关节囊成纤维细胞系,经免疫免疫组化法鉴定,确定培养的细胞是自中胚层的成纤维细胞,为下一步实验的顺利进行提供了可靠的体外实验模型。2实验研究二BMP/Smad信号传导通路在AS成纤维细胞中的表达状况目的：观察比较Smad1、pSmad1、Smad4及成骨标志基因cbfa-1在正常人髋关节囊成纤维细胞与AS髋关节囊成纤维细胞中的表达状况,了解BMP/Smad信号传导通路在AS成纤维细胞中的活化情况,进一步证实活化的BMP／Smad信号通路可诱导AS成纤维细胞向成骨型分化。方法：在北京大学第三医院骨科关节组的协助下,选取因髋关节骨化融合需行全髋关节置换术的AS患者及因外伤致股骨颈骨折需行全髋关节置换术患者的髋关节囊组织,采用组织块原代培养法建立人髋关节囊成纤维细胞系。免疫印迹法检测Smad1、pSmad1、Smad4及成骨标志基因cbfa-1在AS成纤维细胞和正常人成纤维细胞中的表达状况。结果：AS成纤维细胞中的Smad1、pSmad1、Smad4及cbfa-1的表达都较正常成纤维细胞升高(P<0.05)。结论：AS髋关节囊成纤维细胞中Smad1、pSmad1、Smad4蛋白及成骨标志基因cbfa-1的表达在均上调,AS成纤维细胞中的BMP/Smad信号通路处于活化的状态,并且高度表达成骨表型,揭示AS髋关节囊成纤维细胞向成骨型分化的可能机理是BMP/Smad信号传导通路的活化。3实验研究三淫羊藿苷体外实验最佳浓度的确定目的：确定淫羊藿苷抑制体外培养AS髋关节囊成纤维细胞增殖的最佳浓度范围,为下一步实验的进行提供可靠的实验依据。方法：在北京大学第三医院骨科关节组的协助下,选取因髋关节骨化融合需行全髋关节置换术的AS患者的髋关节囊组织,采用组织块原代培养法建立AS患者的髋关节囊成纤维细胞系。MTT法检测不同剂量的淫羊藿苷干预后AS成纤维细胞的增殖情况。结果：淫羊藿苷100ug/ml组可明显抑制AS成纤维细胞增殖(P<0.05),200ug/ml组产生细胞毒,而25ug/ml与50ug/ml浓度组抑制作用不明显(P>0.05)。结论：淫羊藿苷体外抑制AS髋关节囊成纤维细胞增殖的最佳浓度为100ug/ml。4实验研究四淫羊藿苷对AS成纤维细胞BMP/Smad信号传导通路的影响目的：证实淫羊藿苷通过抑制BMP/Smad信号传导通路的活化而阻断AS成纤维细胞向成骨型分化,从而发挥抗AS骨化的作用。方法：在北京大学第三医院骨科关节组的协助下,选取因髋关节骨化融合需行全髋关节置换术的AS患者的髋关节囊组织,采用组织块原代培养法建立AS髋关节囊成纤维细胞系。将成纤维细胞分成AS空白对照组、AS+淫羊藿苷小中、大剂量组,培养细胞72h后,应用免疫印迹法检测Smad1、pSmad1、Smad4及cbfa-1在各组中的表达状况。结果：与AS空白对照组相比,AS+淫羊藿苷大剂量组Smad1、pSmad1、Smad4的表达均减低,二者差异具有显著性(P<0.05);AS+淫羊藿苷组cbfa-1的表达也受到明显抑制(P<0.05)。结论：淫羊藿苷可抑制AS髋关节囊成纤维细胞中BMP/Smad信号传导通路的活化,降低成其骨标志基因cbfa-1的表达,从而延缓AS成纤维细胞向成骨型分化。实验研究总结：淫羊藿苷通过抑制AS成纤维细胞中BMP/Smad信号通路的活化而延缓其向成骨型分化,可能是淫羊藿苷发挥抗AS骨化的分子机制之一。