研究背景：
　　生物钟广泛存在于生物个体当中,对于维持机体正常的生理功能具有重要的作用。近年来,生物钟与心血管疾病之间的关系被广泛关注,据研究报道,生物钟紊乱会对脂质代谢、血压稳态、动脉硬化等产生影响,并对血管造成损伤。然而,有关核心钟基因Bmall对于血管内皮自噬和凋亡的影响报道甚少。
　　研究目的及意义：
　　探究核心生物钟基因Bmall在人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)自噬和凋亡中的作用。以期为钟基因与血管损伤之间的联系提供新的思路。
　　研究方法：
　　以HUVEC为研究对象,1μM地塞米松(dexamethasone,DEX)同步1h,以4h为间隔,提取24h内的细胞mRNA,利用实时荧光定量PCR测定Bmall基因的昼夜时间表达谱,确定Bmall基因表达的峰值时点,并在该时点进行siRNA干扰(脂质体2000转染),测定不同时点Bmall基因的敲降效率。保持Bmall基因敲降实验条件不变,MTT检测转染敲降对内皮细胞的活性影响。用单丹磺酰尸胺(Monodansvlcadaverine,MDC)染色和荧光显微镜拍照观察细胞自噬情况变化;以实时荧光定量PCR检测敲降Bmall基因后内皮细胞自噬相关基因Beclin-1、p62、LC3的表达量变化,用Western blot检测自噬相关蛋白p62和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的相对表达量的变化。利用Hoechst染色方法,在荧光显微镜下拍照观察敲降Bmall基因后内皮细胞凋亡的变化情况,实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达量变化,用Western blot检测Bcl-2、Bax以及Bcl-2/Bax的相对表达量。ROS(Reactive oxygen species,ROS)荧光探针检测Bmall基因敲降后内皮细胞活性氧水平的变化。
　　研究结果：
　　在HUVEC中,Bmall基因呈现昼夜节律性表达,符合余弦函数曲线,峰值时刻出现于CT12。脂质体2000-siBmall转染细胞后,MTT检测结果显示,转染过程并未造成内皮细胞活性的明显变化。在自噬方面,通过MDC染色观察发现,相比于阴性对照组(Negative control,NC),敲降Bmall基因后内皮细胞的自噬水平增加,并且qPCR检测自噬相关基因Beclin-1、LC3的表达量有明显增加,p62基因表达稍有下降,蛋白检测结果发现,p62表达量显著降低,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著升高。在凋亡方面,Bmall敲降的细胞更易被Hoechst染色,呈现出致密浓染的细胞核,基因检测显示,凋亡相关基因Bax、Caspase3的表达量均有所增加,Bcl-2的表达量也有所增加,细胞蛋白检测发现,促凋亡蛋白Bax未有明显变化,但抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量显著降低,Bcl-2/Bax比值显著降低。ROS染色发现,Bmall基因敲降后增多内皮细胞超氧化物的产生。
　　研究结论：
　　血管内皮细胞Bmall基因呈现昼夜节律性表达;下调Bmall可提高血管内皮细胞的自噬和凋亡水平,可能与细胞超氧化物增多有关。