体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术作为治疗不孕症的辅助生殖手段目前已在临床得到广泛应用,胚胎质量和子宫内膜容受性直接影响胚胎能否顺利着床,与成功率密切相关。随着不断改良优化的超促排卵方案在临床上的实施以及日益提高的体外胚胎培养技术,胚胎质量的问题已经得到很大的提高,优胚占比不断提高,但胚胎移植的成功率仍然徘徊在一个较低的水平[1],其中与子宫内膜容受性有很大的关系。子宫内膜容受性和众多方面有关系,比如宏观方面:子宫内膜厚度和形态,子宫内膜血流信号和子宫内膜下血流信号,子宫内膜蠕动波;微观方面有留体激素、各种细胞因子和局部免疫信号的传导等。如何更好的评估并提高子宫内膜容受性一直是生殖领域的研究课题。现一些研究表明,胚胎移植操作可能导致子宫收缩进而影响子宫内膜的容受性,影响胚胎的植入和着床导致成功率下降[2]。在超声引导下胚胎移植操作有了很大的进步,但是仍不可避免会遇到困难移植病例。有学者认为当遇到困难移植时,反复增加的额外操作甚至创伤使得子宫收缩增加,继而引起子宫内膜蠕动波增强,影响子宫内膜的容受性,进而阻止了胚胎的及时定位和黏附,最终导致胚胎着床的失败,成功率明显下降[3][4]。子宫收缩依赖于缩宫素与位于子宫肌层细胞中的缩宫素受体结合起作用。研究发现[5][6]缩宫素/加压素拮抗剂阿托西班能够抑制妊娠子宫的收缩,应用于中晚期流产的保胎治疗及预防早产的治疗中效果良好;亦可抑制非妊娠子宫的收缩,增加血流供应,提高子宫内膜的容受性[7]。2007[4]年有学者首次将阿托西班应用于生殖领域,使得1例有7次移植失败的患者在移植前子宫收缩频率明显降低并成功妊娠。近年来,很多生殖领域的研究表明阿托西班能提高反复移植失败患者的成功率,但均将困难移植的病例排除。为了改善困难移植患者的临床结局,提高IVF成功率,我们首次选择应用阿托西班以期望能改善子宫内膜容受性进而提高患者的临床妊娠率。本研究第一部分为临床研究。1.比较困难移植病例与同期顺利移植病例间的临床各项指标和结局,以探讨发生困难移植时IVF临床结局的变化。2.选择首次移植时发生了困难移植而未孕者再次行冻胚复苏移植(FET)治疗的患者为研究对象,探讨其应用缩宫素/加压素拮抗剂阿托西班后能否改善该类患者的临床结局。从微观角度来讲,子宫内膜的容受性受到多种生物信号的调控包括:甾体激素、细胞因子、生长因子、细胞粘附因子以及转录因子等[8]。它们的变化会造成子宫内膜容受性的改变,导致胚胎的着床率和妊娠率的下降。当完成胚胎移植的操作后,胚胎和子宫内膜互相识别、作用并在一段非常短暂的时期共同作用完成胚胎着床,这些因子起着非常重要的作用,到目前为止,机制还不是十分清楚。转化生长因子(TGF)-β家族是一类多功能的细胞因子,以自分泌或旁分泌的方式广泛参与哺乳类动物的各种病理生理过程,与生殖多个方面亦密切相关,如对卵泡和黄体的发育、子宫内膜功能的调节、胚胎植入等。骨形成蛋白(BMP)作为TGF-β超家族中一员,同样几乎参与全身各个器官的功能调节,如细胞发育、凋亡、分化、关节维护、骨折修复、血管重塑,因此提出BMP称为身体形成蛋白更为合适[9]。研究发现,BMPs在胚胎形成和发展中起重要作用,在BMPs信号通路受损后发现胚胎出现致命性或明显的缺陷;还参与卵泡黄素化后颗粒细胞的分泌功能调节,调节囊胚的植入、子宫内膜上皮细胞的分解和胎盘的发育[10]。BMP7作为BMPs中的一员,研究表明其可增加卵巢颗粒细胞上VEGF的表达及VEGF受体的敏感度进而促进卵泡的发育[11],而在PCOS患者中BMP7则出现了异常的表达[12],但关于BMP7在胚胎着床和子宫内膜容受性中的作用尚未被评估。内皮素(Endoglin)/CD105属于一种跨膜糖蛋白,作为辅助TGF-β受体,Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β受体作用于3型受体即Endoglin形成共受体,经smad转录因子家族成员等下游因子磷酸化的途径发挥作用[13]。Endoglin存在于子宫内膜间质细胞和上皮细胞中[14],其在子宫内膜容受性及与BMP7间的相互作用还不清楚。本研究第二部分为实验部分。通过建立怀孕小鼠模型及人胚胎植入体外模型,并采用siRNA干扰技术,旨在研究BMP7及Endoglin在胚胎着床及子宫内膜容受性中的相关机制,为临床不孕不育的治疗和辅助生殖技术的应用提供新的理论依据。第一部分 阿托西班在IVF困难移植患者中的应用效果目的:分析困难移植患者的IVF临床结局并观察缩宫素/加压素拮抗剂阿托西班在困难移植患者中的应用效果。材料与方法:选取山西省人民医院生殖中心在2014年6月-2018年6月期间首次移植发生困难移植的病例249例,比较其与同期顺利移植患者间的临床各项指标及结局。困难移植患者未怀孕者入组共204例,再次行FET随机分为两组,阿托西班组(n=102)于FET前30分钟开始静脉给予37.5mg阿托西班,对照组(n=102)FET前输入等量的空白生理盐水为参照。比较两组间临床妊娠率、胚胎着床率、多胎率、流产率、异位妊娠率的差异。结果:困难移植患者的临床妊娠率及胚胎着床率明显低于顺利移植患者组,分别为16.1%&9.6%和50.0%&30.3%,差异具有统计学意义,两组间在多胎发生率、流产及异位妊娠的发生方面无统计学差异。入组204例患者再次行胚胎移植时,阿托西班组的患者临床妊娠率及胚胎着床率分别为45.1%、26.5%均明显高于对照组15.6%的临床妊娠率和9.7%的胚胎着床率,差异有统计学意义;两组间的多胎率、流产率、异位妊娠率无统计学差异。结论:1.体外受精胚胎移植中困难移植者的临床妊娠率、胚胎着床率均明显下降。2.阿托西班可以改善困难移植患者再次移植时子宫内膜的容受性,提高临床妊娠率和胚胎着床率,从而改善其FET的妊娠结局。第二部分 BMP7通路在子宫内膜容受性中相关机制的研究目的:通过妊娠小鼠模型和人胚胎植入体外模型,并应用RNA干扰技术旨在研究BMP7及Endoglin在胚胎植入和子宫内膜容受性中的作用,为辅助生殖技术的实施及不孕不育的治疗提供新的基础理论依据。材料与方法:1.采用Western-blot、免疫荧光技术和siRNA干扰技术检测BMP7及Endoglin在小鼠围着床期子宫内膜中的表达规律及分析两者间的相互关系。2.利用siRNA干扰技术,在不同组别将siRNA-BMP7、siRNA-Endoglin稀释液分别注入着床前小鼠宫腔,研究注射siRNA-BMP7后Endoglin蛋白的表达变化,并且分析注射siRNA-Endoglin后小鼠胚胎种植的情况,进而探讨BMP7-Endoglin通路在小鼠胚胎着床及子宫内膜容受性中的作用。3.体外实验时利用人子宫内膜癌ISK(Ishikawa)细胞与人绒毛膜癌JAr细胞建立人体外胚胎着床模型,通过siRNA-BMP7技术研究体外Jar spheroids粘附程度的变化,进而探讨在人胚胎植入过程中,BMP7是否通过Endoglin介导子宫内膜容受性的变化而影响胚胎植入。结果:1.BMP7蛋白在小鼠围着床期表达分别为(0.517±0.003,0.789±0.029,2.313±0.033,1.433±0.073),其随着胚胎的植入表达逐渐增高,在胚胎植入期表达量最高。Endoglin在小鼠围着床期的表达呈现同样的规律,分别为(0.027±0.002,0.347±0.006,0.783±0.016,0.381±0.003),胚胎植入期与其它时期表达量差异具有统计学意义,并且在胚胎植入部位Endoglin的表达明显高于非种植部位(0.896±0.006,0.435±0.004),差异有统计学意义。使用siRNA干扰BMP7的表达后,可以看出Endoglin的蛋白表达量也明显下降(0.367±0.031,0.010±0.009),差异有统计学意义。2.在着床前期小鼠的一侧子宫角注入siRNA-BMP7稀释液后以沉默BMP7的表达,胚胎着床期子宫内膜组织中BMP7表达量为(0.347±0.015&0.011±0.003),在BMP7表达降低的同时可以看出Endoglin在两组间的差异表达有统计学意义(0.367±0.031&0.010±0.009,P<0.05)。同法在着床前期一侧子宫角注入siRNA-Endoglin稀释液,可显著的降低了该侧胚胎的种植数目,差异有统计学意义(10.2±1.4,4.75±1.15)。3.在体外胚胎植入模型中,通过siRNA-BMP7干扰技术后,明显抑制ISK细胞与模型胚胎-Jar spheroids的粘附率,与对照组比较差异有统计学意义(0.895±0.020,0.215±0.053)。结论:通过体内体外实验证实BMP7可能通过Endoglin介导的通路参与了子宫内膜容受性的调节,促进了子宫内膜上皮细胞的分化和重塑,对胚胎着床有重要的作用。