论文部分内容阅读
目的以牛Ⅱ型胶原加弗氏完全佐剂建立胶原诱导型类风湿关节炎（CIA）大鼠模型,观察黄芪桂枝五物汤（HGW）对模型大鼠的关节炎指数、关节病理、足趾肿胀度、血流变、滑膜细胞凋亡、相关细胞因子和JAK3/STAT3信号通路等的影响,以探讨黄芪桂枝五物汤（HGW）对胶原诱导型类风湿关节炎大鼠的治疗作用及其机制。方法SPF级SD雄性大鼠72只,适应性喂养1周后,随机分为2组:N组（12只）和CIA组（60只）。将牛Ⅱ型胶原与弗氏完全佐剂1:1充分乳化,即胶原浓度为1 g·L-1。于CIA组每只大鼠右后足爪、背部、尾根三点各皮下注射乳化剂0.1 mL,7 d后以0.1ml乳化剂加强免疫一次,以免疫加强当天为d 1。致炎后d 15,将CIA组随机分为五组:CIA组、黄芪桂枝五物汤低剂量（HGW-L）组、黄芪桂枝五物汤中剂量（HGW-M）组、黄芪桂枝五物汤高剂量（HGW-H）组及Tofacitinib（TFN）组。将黄芪桂枝五物汤常规煎煮并浓缩药物,按10 mL·kg-1体质量ig给药。HGW-L、HGW-M、HGW-H组药物剂量分别为16、32、64 g·m L-1,相当于临床常人用量的3、6、12倍,TFN药物剂量为15 mg·kg-1,N、CIA组每日给予10 mL·kg-1的蒸馏水,疗程均为4周。胶原诱导型关节炎（CIA）大鼠模型建立完成后,每周采用水容积法测量大鼠下肢容积;对大鼠关节炎指数进行评分;经HGW治疗4周后光镜下观察各组大鼠踝关节病理形态;TUNEL染色检测大鼠滑膜细胞的凋亡。采用全自动血流变仪检测大鼠外周血中全血高切及低切粘度;ELISA法检测大鼠外周血中CollagenII Ab抗体、IL-1β、IL-3、GM-CSF、IL-8、IL-11、IFN-r、RF、CRP等细胞因子的含量;流式细胞术检测外周血中IL-2、IL-4、IL-10、IL-1、IL-6、TNF-α等细胞因子的含量;免疫组化法检测大鼠滑膜组织中VEGF、Bcl-2、BAX、SOCS1、SOCS3、STAT1、STAT3、JAK3的蛋白表达水平;采用Western blot技术分别从基因和蛋白的角度来观察STAT3、JAK3及其负反馈调节因子SOCS1、SOCS3的蛋白表达水平。结果N组大鼠毛色白亮、光泽度好,进食可,四肢活动自由,反应灵敏,足爪未见肿胀,体重增长快且平稳;CIA组大鼠毛发暗淡无光泽,进食明显减少,双后足肿胀溃烂伴跛行,时有哀鸣、喜扎堆,弓背蜷缩,摄食量降低,大便质稀,反应迟钝,体重增加不明显;各用药组大鼠毛色光泽度及进食较前改善,双后足肿胀度及跛行减轻,活动量增加,体重增长平稳。造模完成后,大鼠双足足跖及踝关节出现红肿热等急性免疫反应;第2周,与N组比较,CIA组大鼠足趾肿胀度极显著升高（P<0.01）;第2周和第6周,与N组相比,CIA组大鼠关节炎症积分极显著差异（P<0.01）。第2周,与CIA组相比,TFN组和HGW-L、M、H组大鼠关节炎症积分未见明显差异,无统计学意义（P>0.05）;第6周,与CIA组相比,TFN组和HGW-M、H组大鼠关节炎症积分差异显著（P<0.05,P<0.01）。与N组相比,CIA组大鼠血清RF、CRP、CollagenII抗体含量有极显著差异（P<0.01）。在光学显微镜下观察发现:N组大鼠滑膜细胞排列规则无增生,血管散在分布,关节腔内未见渗出物,关节表面光滑。CIA组大鼠滑膜细胞大量增生、血管翳形成,可见大量炎性细胞浸润,关节面粗糙,关节软骨破坏严重。TFN组和HGW-L、M、H用药组干预后不同程度抑制了滑膜组织的增生,单核及淋巴细胞有不同程度的减少。与N组比较,CIA组大鼠STAT3、SOCS1蛋白表达水平显著升高（P<0.05,P<0.01）;与CIA组比较,HGW-H组大鼠STAT3、JAK3、SOCS1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）;与CIA组比较,TFN组大鼠JAK3蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。与N组相比较,CIA组大鼠滑膜细胞增多,凋亡率显著下降（P<0.05）;与CIA组比较,HGW-H组大鼠Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。与N组比较,CIA组大鼠在30/s、1/s切变率下的全血粘度和200/s切变率下的血浆粘度、红细胞聚集指数均显著升高（P<0.01）;与CIA组比较,HGW-H组、TFN组大鼠IL-4、IL-10的含量显著升高（P<0.05,P<0.01）;与N组比较,CIA组大鼠IL-1β的含量显著升高（P<0.05）,IL-3、GM-CSF含量显著降低（P<0.05）。结论（1）黄芪桂枝五物汤对CIA模型大鼠足趾的关节炎症有明显的治疗作用,其机制可能是HGW通过调节了CIA大鼠外周血中炎细胞因子IL-2、IL-1、IL-6、IL-4、IL-10、TNF-α、IL-1β、IL-8、IFN-r、RF、CRP、CollagenII的分泌,对减少软骨细胞的损伤和凋亡,减轻软骨和滑膜的损伤,保护关节起到抗炎,调节免疫的作用。（2）黄芪桂枝五物汤能够促进滑膜细胞的凋亡,可能是其治疗类风湿关节炎的机制之一。（3）黄芪桂枝五物汤通过对JAK3/STAT3信号通路蛋白的抑制作用而起到抗炎和免疫调节。