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泡状细胞是大的,薄壁并且高度液泡化的细胞,与应答干旱和高温时叶片卷曲有关。同时,卷叶是水稻育种中重要的农艺性状。为了了解控制卷叶的分子机制,本文报道了一个卷叶突变体shallot-like 2(sll2)。该突变体从六叶期开始叶片向近轴面极度内卷,其光合效率增高,株高和分蘖数减少。组织学分析表明,泡状细胞皱缩导致内卷叶。该突变体是隐性的,回复突变率9%。卷叶表型是由T-DNA插入引起的。利用TAIL-PCR进行位点克隆表明T-DNA插入在LOC_Os07g38664的启动子区,出乎意料的是,LOC_Os07g38664被35S启动子加强表达并不是引起卷叶表型的原因。此外,增强子可以长距离的发挥作用,包括上调了几个泡状细胞相关基因·在sll2oul1双突变体中,sll2抑制了oul1的外卷叶表型,我们推测sll2的卷叶表型可能是多基因综合效应,表明泡状细胞发育存在一个复杂的调控网络。本文主要研究结果如下:1.与野生型Kitaake相比,突变体的育性良好,种子正常,但是株高降低,分蘖数减少,叶片较窄并且叶色更加深绿。经测量发现sll2叶绿素含量和类胡萝卜素含量显著提高,光合效率增加。蒸腾速率略有减少,但是差异不显著。为了研究结构上究竟如何变化引起的内卷叶,进行组织学切片分析,发现突变体沿着叶片近轴面,泡状细胞发生了严重的萎缩,且泡状细胞的面积减少到野生型的60%左右。这导致叶片背面(远轴面)和腹面(近轴面)发育不协调,从而使叶片向内卷成葱管状。2.遗传分析显示sll2由单个隐性基因控制,突变体的葱卷叶表型是由T-DNA插入引起的.采用TAIL-PCR(热不对称性聚合酶链式反应)方法,我们得到了 T-DNA插入位点的侧翼序列,并且发现T-DNA插入在LOC_Os07g38664的5’UTR上游126bp处,T-DNA在与水稻基因组重组中造成左臂(left border)和35S启动子上5’端一个增强子(enhancer)的缺失。我们检测到下游基因LOC_Os07g38664表达量在突变体中显著性上调近13倍。该基因含有3个外元,2个内元,编码未知功能蛋白。但是构建过表达(转入野生型愈伤组织)和干扰载体(转入突变体愈伤组织)转化后得到的转基因植株与受体表型相同。因此LOC_Os07g38664基因不是目的基因。为了进一步验证TAIL-PCR的结果、寻找目的基因,利用sll2与籼稻93-11配组合得到的F2代群体中459个极端内卷叶个体,将这个基因定位在第7染色体长臂上28.6-kb的范围内,其中包含了T-DNA插入位点和10个ORF(开发阅读框),这10个基因中没有与已知的控制叶形相关的基因,但是包含了在突变体中上调表达的LOC_Os07g38664。对定位区间内序列进行测序后没有发现野生型和sll2之间存在序列差异。研究表明,35S启动子由2个串联重复的增强子构成,它们不仅可以启动下游基因的表达,而且会影响到更远距离的基因表达。因此我们推测由于T-DNA上剩余一个完整35S增强子的存在,导致此增强子会影响到附近的基因,甚至是定位区间外的基因。于是进行了数字基因表达谱分析试图找到表达水平发生变化的基因。有5个基因,包括LOC_Os07g38664,在sll2中上调了 10倍以上,然而没有发现导致卷叶的基因。3.经过两年的观察我们发现在纯合的突变体后代中有9%的回复突变体sll2-Rev。回复突变体的叶片像野生型一样是平展的,LRI与WT类似。组织学切片表明回复突变体;sll2-Rev中泡状细胞回复成正常大小,泡状细胞面积也与野生型中相当。此外,其它的农艺性状如株高,分蘖数,千粒重,叶片宽度都回复到了与野生型Kitaake相当的水平。在回复突变体中检测到了T-DNA插入的存在,并且T-DNA插入位置没有发生变化。所以推测可能是T-DNA在特定情况下可以引起目的基因表达从而产生卷叶表型。但当染色质结构发生变化后,增强子不能调控,SLL2,导致回复突变体sll2-Rev恢复叶片平展。4.为了研究sll2与oul1外卷叶突变体(该突变体的泡状细胞数量增多和尺寸变大)之间的关系,构建了双突变体sll2oul1。突变体oul1的外卷叶表型是由于Roc5功能缺失引起的。Roc5是一个转录因子,编码一个拟南芥GL2的同源产物,GL2编码产物为HD-Zip Ⅳ蛋白家族的一个成员,是一个负调控泡状细胞发育的基因。在sll2oul1双突变体中,外卷叶的表型受到了抑制,双突变体表现明显的内卷叶,组织学切片显示,双突变体中泡状细胞的面积明显减少。因此认为,SLL对Roc5具有上位性。并且在双突变体sll2oul1中,sll2与oul1互相补足了对方的劣势,双突变体sll2oul1的株高,分蘖较sll2显著提高,而叶色和结实率都较oul1显著增加。这个结果表明,构建形态正常,适度卷叶的理想株型可以通过结合不同卷叶突变体的优势以及调控不同的卷叶相关的基因来实现。前人的研究表明PFL很可能是Roc5作用的下游靶基因,因此也检测了PFL的表达,结果显示,Roc5和PFL在sll2中的表达量均上调。有趣的是PFL的表达水平在双突变体sll2oul1中下降到了与野生型相当的水平。因此,SLL2负调控Roc5,相应地负调控PFL。5.SLL1编码一个KANADI转录因子,sll1-l突变体由于远轴面厚壁细胞发育存在缺陷,导致内卷叶表型。与内卷叶突变体sll1-1构建了sll1-1sll2双突变体,可以观察到sll1-1sl2双突变体表现为内卷叶,sll1-1sll2双突变体的卷叶指数(LRI)介于sll1-1和sll2二者之间。除了在叶片弯曲处缺少厚壁细胞以外,近轴面的泡状细胞也数量减少面积变小。此外,SLL1基因在sll2中以及回复突变体sll2-Rev中表达水平只有极微弱的变化,由这些结果推断,SLL1和SLL2在调控泡状细胞发育方面可能是各自独立地发生作用.