胆囊是胆道系统中最主要的组成部分,引发慢性结石性胆囊炎主要病因是因为胆囊运动功能减弱。胆囊动力的减弱不但是大多数胆囊炎、胆囊结石症等疾病发病机制的主要环节并且也是这些疾病关键的继发性病理改变。因此,探索胆囊运动功能障碍和机制是预防胆道疾病的重要研究领域。Cajal间质细胞（Interstitial cells of Cajal,ICC）是胃肠道的起搏细胞,通过Ca²⁺的释放和摄取,浓度周期性增加,形成胞内Ca²⁺循环振荡,产生慢波,调节胃肠平滑肌的节律。研究表明,胆囊中也含有ICC,也具有调节胆囊收缩的功能。祖国医学中慢性结石性胆囊炎归属于“胆胀”、“肋痛”范畴,茵陈蒿汤最早记载于张仲景《伤寒论》的辨阳明病脉证并治篇,药方由君药茵陈、臣药栀子和佐药大黄三味药共同组成,拥有清热、利湿、退黄的功效。本课题组在之前的调查研究发现茵陈蒿汤在临床上用来治疗慢性结石性胆囊炎,具有一定的疗效。进一步研究显示茵陈蒿汤能够显著增加胆囊ICC的数量,增强胆囊括约肌收缩力,达到缓解胆囊动力障碍的目的。本研究前期建立慢性结石性胆囊炎豚鼠模型,构建模型中药治疗后,运用HE染色评价胆囊炎症,然后酶解法提取胆囊内ICC原代细胞,经硝苯地平预处理后检测ICC内Ca²⁺浓度、IP₃浓度和IP₃R受体蛋白表达水平的变化。目的观测茵陈蒿汤对慢性结石性胆囊炎豚鼠ICC细胞胞内Ca²⁺浓度的影响并探索该细胞内Ca²⁺调节相关机制,揭示茵陈蒿汤治疗慢性结石性胆囊炎调节胆囊运动的作用机制。方法1.参考周文江等方法^[1]建立慢性结石性胆囊炎豚鼠模型,用HE染色评价胆囊组织炎症加以鉴定;2.酶解法分离胆囊ICC细胞,倒置显微镜下观察ICC形态学变化并采用anti c-kit进行标记在激光共聚焦显微镜下进行鉴定。3.选取硝苯地平预处理各组细胞,用fluo-4/AM负载ICC细胞,选用荧光探针Fluo-4/AM、FuraRed双标记比率方法测定ICC细胞胞内Ca²⁺浓度变化;4.采用硝苯地平预处理各组细胞,运用细胞三磷酸肌醇（IP₃）含量化学比色法定量检测试剂测定胆囊ICC内IP₃的浓度并采用Western Blot检测IP₃R受体蛋白表达强度。观察组间差异,揭示茵陈蒿汤对慢性结石性胆囊炎胆囊运动的调节作用方式。结果给三到四个月龄试验用健康级雄性豚鼠喂食致石饲料两个月,成功建立慢性结石性胆囊炎豚鼠模型,两个月后随即分为正常组、模型组和治疗组。治疗组给予茵陈蒿汤灌胃治疗持续一个月,正常组和模型组则用生理盐水代替参照。取胆囊组织进行HE染色光镜下显示:正常组分离的胆囊组织是完整的,没有充血或明显的炎性细胞浸润;慢性结石性胆囊炎模型组胆囊组织显示水肿,充血和相当大的炎性细胞浸润,成纤维细胞增生;中药治疗组症状明显好转,没有明显的水肿充血,有少量炎性细胞浸润,模型鉴定成功。酶解法分离提取ICC原代细胞,显微镜下观察ICC细胞体积较小,数量较少,细胞多呈纺锤形或长梭形,有明显的突起。用anti c-kit抗体标记鉴定提取的细胞,激光共聚焦显微镜下ICC细胞为红色,模型组ICC原代细胞数量跟正常组相比显著减少,治疗组跟模型组对比ICC原代细胞数量明显提升。流式细胞术检测Ca²⁺浓度显示:模型组豚鼠胆囊ICC内Ca²⁺浓度较正常组显著下降,中药治疗组较模型组有明显的提高,并且浓度变化趋势不受硝苯地平的影响。IP₃含量化学比色法定量检测和Western Blot结果显示:模型组IP₃浓度和IP₃R受体蛋白表达水平跟正常组相比均显著降低,而治疗组比模型组明显升高,变化趋势与Ca²⁺浓度相同。结论茵陈蒿汤能够通过提高ICC内IP₃和IP₃R受体蛋白浓度,促进内质网钙库细胞器IP₃依赖性Ca²⁺释放通道对细胞内钙库的动员能力,释放Ca²⁺进入细胞内,增加细胞内Ca²⁺浓度,激活ICC起搏电流,增强胆囊的收缩性,减轻胆汁的淤积,从而达到治疗慢性结石性胆囊炎的目的。