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猪圆环病毒（Porcine Circovirus,PCV）是一种单股环状DNA病毒,无囊膜,属于圆环病毒科,圆环病毒属成员。目前已报道的猪圆环病毒分为4个血清型:PCV1、PCV2、PCV3和PCV4。其中,PCV1无致病性,PCV2是引起多种圆环病毒相关疾病的主要病原,抑制动物机体的免疫功能,从而易导致猪群继发其他病原感染,严重威胁猪群健康。PCV3是一种新发现的PCV,多见于猪皮炎和肾病综合征,断奶仔猪多系统衰竭综合征,仔猪和母猪心肌炎、母猪繁殖障碍症状猪群。最近,在我国湖南又发现了 一种新PCV,其基因组与水貂圆环病毒基因组一致性最高,为66.9%,暂命名PCV4。PCV3基因组全长2.0Kb,病毒粒子呈二十面体结构,无囊膜,直径为17-20nm。PCV3基因组包含3个主要的开放阅读框（open reading frame,ORF）,ORF1编码复制酶蛋白Rep,全长由297个氨基酸（amino acid,aa）构成,主要参与病毒的复制过程。ORF2编码衣壳蛋白Cap,全长214个aa,是PCV3的结构蛋白。ORF3编码一个由231个aa组成的蛋白,功能尚不明确。Cap蛋白作为PCV3唯一的结构蛋白,是诱导机体产生免疫应答的主要免疫原,但其与PCV2 Cap蛋白氨基酸的同源性仅为30%,且两者不具有共同的线性表位,故现有PCV2疫苗无法对PCV3感染提供有效免疫保护,PCV3疫苗研发迫在眉睫。目前PCV3分离和培养技术尚不成熟,若能基于高质量高产量的病毒主要抗原Cap蛋白制备PCV3亚单位疫苗,将能为PCV3相关疾病的防控提供有力武器。为此,本研究拟利用昆虫杆状病毒系统高效表达PCV3 Cap蛋白,为PCV3亚单位疫苗研发奠定基础。1、PCV3 Cap蛋白昆虫杆状病毒表达系统的构建本研究首先对PCV3 ORF2基因进行了密码子优化,在其5’端添加GP67信号肽和KOZAK序列。为方便后续纯化,我们在ORF2基因3’端添加His标签序列,并将优化后的基因克隆至pFastBac1供体质粒中。将鉴定为阳性的重组质粒转化入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,利用蓝白斑筛选,提取经PCR及测序鉴定正确的重组Bacmid穿梭载体。利用LipoInsect转染试剂将重组Bacmid转染入sf9昆虫细胞中,从而得到重组杆状病毒。利用Western blot、间接免疫荧光鉴定获得的重组杆状病毒的正确性与有效性。在此基础上将获得的重组杆状病毒扩增为高滴度的杆状病毒,蚀斑试验测定该重组杆状病毒的毒价为108pfu/ml,Western blot实验确定Cap蛋白表达的最优感染复数为5,最优表达时间为感染后72h。2、PCV3 Cap蛋白纯化及VLP的制备以此杆状病毒感染sf9细胞,大量表达Cap蛋白,通过亲和层析、分子筛及蔗糖密度梯度离心对收集的Cap蛋白进行纯化。最后,对Cap蛋白体外组装病毒样颗粒（virus-like particals,VLP）的条件进行优化,电镜下观察到大量的不规则的蛋白聚集,仅有小部分可形成类似VLP的结构,直径约为20 nm,但形状并不十分规整,没有呈现典型的二十面体结构,表明PCV3 Cap蛋白能够组装为VLP,但PCV3 VLP组装的最宜条件还需进一步摸索。3、PCV3感染性克隆的构建PCV3分离和培养技术尚不成熟,利用感染性克隆技术获得可大量培养的PCV3将为深入研究复制及致病机制奠定重要基础。本研究构建了PCV3的感染性克隆载体,经测序验证后转入PK15细胞中进行连续传代,并利用IFA验证转染后第一代及第十代的荧光情况,IFA结果发现,转染第1代后,转染pSK-PCV3重组质粒及PCV3环状基因组的PK15细胞均可检测到绿色荧光,且荧光主要分布于PK15细胞胞浆中,细胞核中不见绿色荧光,当继续盲传至第10代,绿色荧光消失,PCV3病毒未能成功拯救。同时,我们还构建了 PCV2的感染性克隆,经过连续传代后,IFA鉴定成功检测到荧光,说明PCV2的感染性克隆构建成功,并成功拯救出PCV2。本研究基于PCV3 Cap蛋白的特性,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,在昆虫细胞中表达PCV3 Cap蛋白,为研制安全有效的PCV3基因工程亚单位疫苗奠定了基础。