T淋巴细胞在脊髓损伤修复中的作用研究

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免疫炎症反应是脊髓继发损伤的重要因素,包括固有免疫反应和适应性免疫反应。固有免疫反应通过抗原提呈作用和细胞因子的释放激活适应性免疫,同时也是适应性免疫的效应系统,二者之间相互联系,相互作用共同维持机体内环境稳定。研究发现,适应性免疫的T淋巴细胞对固有免疫反应的调节有重要意义,能通过抑制炎症因子的释放,防止固有免疫过度活化而造成组织损伤。脊髓损伤后的免疫炎症反应过程同机体其它部位的炎症反应有相似之处,但也有其独特性。T淋巴细胞在脊髓损伤修复中的具体作用及其机制目前尚不十分清楚。本研究采用无胸腺裸鼠、胸腺摘除小鼠和CD4抗体注射方法建立小鼠T淋巴细胞或CD4+T淋巴细胞缺失的动物模型,通过功能学评分、组织学染色、实时定量PCR等方法,探讨T淋巴细胞在脊髓损伤修复中的作用。实验共分为如下三个部分:第一部分【目的】用小鼠脊髓夹伤模型,比较观察BALB/c小鼠和BALB/c背景的无胸腺裸鼠(BALB/c-nude-/-小鼠,以下简称裸鼠)脊髓损伤恢复情况。【方法】6-8周雄性BALB/c小鼠和BALB/c-nude-/-小鼠,麻醉后行脊髓T8节段重度夹伤模型。损伤后用BMS评分评估小鼠后肢运动功能恢复情况;GFAP标记胶质瘢痕,评估比较损伤区面积;NeuN标记神经元,观察损伤区及其周边神经元的存活情况;Luxol-Fast blue染色,观察损伤后脊髓吻尾侧端髓鞘变性情况。【结果】BMS评分结果显示小鼠脊髓损伤后随时间推移后肢运动功能逐渐恢复,14d可达至平台期,其中裸鼠损伤后运动功能恢复在多个时间点都明显好于对照的BALB/c小鼠。免疫组织化学结果显示脊髓损伤后7d裸鼠损伤区面积(0.33±0.04mm2)明显小于对照组(0.57±0.04mm2),缩小约42%。NeuN染色显示小鼠脊髓损伤后7d损伤区吻尾侧端0.8mm内的神经元数目明显下降,在尾侧端距离损伤区0.4mm处裸鼠存活神经元数目略多于对照组,但无统计学差异。Luxol fast blue髓鞘染色显示裸鼠损伤区及其周围白质病变轻于对照的BALB/c小鼠。第二部分【目的】比较观察BALB/c小鼠和裸鼠脊髓夹伤早期各时间点损伤区细胞因子IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、MIP-1和MCP-1的表达变化情况。【方法】6-8周雄性BALB/c小鼠和裸鼠,麻醉后行脊髓T8节段重度夹伤模型,分别于术后6h、12h、24h、3d和7d取以损伤区为中心共5mm脊髓,用TRIzol试剂提取总RNA,反转录后进行实时定量PCR检测上述各基因的表达情况。【结果】小鼠脊髓损伤早期,损伤区促炎因子IL-1β、IL-6及趋化因子MCP-1、MIP-1急剧升高,6h内即达高峰,随后开始下降,3d内归于正常;而炎症抑制因子IL-4早期不升反降,3d降至最低,IL-10在6h有轻微升高。BALB/c小鼠和裸鼠两组之间这几种细胞因子在各时间点的表达均无明显差异。第三部分【目的】用新生鼠胸腺摘除手术和CD4单克隆抗体(克隆号:GK1.5)腹腔注射的方法分别建立循环血中T淋巴细胞缺失和CD4+T淋巴细胞缺失的动物模型,进一步探讨验证第一部分结果。【方法】新生0-3d BALB/c小鼠体视显微镜下摘除胸腺,由ICR母鼠代乳,饲养至6-8周成年,流式细胞术检测脾脏内T淋巴细胞以确定手术效果后,行脊髓夹伤手术,术后不同时间点用BMS评分评估小鼠后肢运动功能恢复情况。将CD4杂交瘤细胞接种至裸鼠腹腔,制备含CD4单克隆抗体的腹水,注射入成年BALB/c小鼠,200μl/次只(对照组给予等量0.01M无菌PBS),隔两天注射一次,注射三次后流式细胞术检测脾脏内CD4+T淋巴细胞以确定作用效果。之后行脊髓夹伤手术,术后不同时间点用BMS评分评估小鼠后肢运动功能恢复情况。【结果】脊髓损伤后随时间推移后肢运动功能逐渐恢复,同正常BALB/c小鼠相比,胸腺摘除小鼠脊髓损伤后后肢运动功能BMS评分无明显差异;同样,和PBS注射组相比,CD4抗体注射组小鼠BMS评分也无明显差异。结论通过以上三部分实验我们可得出以下结论:1.脊髓损伤后无胸腺裸鼠在功能学和组织学上的恢复均明显好于对照的BALB/c小鼠;2.无胸腺裸鼠同对照的BALB/c小鼠相比,脊髓损伤后一周内损伤区炎症因子表达无明显差异,均为促炎因子表达增加,炎症抑制因子表达不变或减少,可能使损伤局部的炎症反应呈扩大趋势,从而导致继发的炎症损伤;3.用新生鼠胸腺摘除手术和CD4抗体注射的方法去除小鼠血液循环中成熟的T淋巴细胞或CD4+T淋巴细胞对小鼠脊髓损伤后运动功能的恢复无明显影响;4. BALB/c背景的小鼠体内,T淋巴细胞对脊髓损伤修复可能并无明显作用,而促进裸鼠脊髓损伤恢复的原因可能并不是其体内缺少T淋巴细胞。
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