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钙周期素结合蛋白（CacyBP）最初是由Filipek等人在小鼠艾氏腹水细胞瘤中发现的S100A6蛋白的靶分子，之后有学者在人细胞中发现一种与Siah-1结合的蛋白，称为Siah-1结合蛋白，简称SIP。经序列分析比较，CacyBP与SIP之间有93%同源性，提示SIP即为人CacyBP。 CacyBP/SIP编码229个氨基酸，其蛋白分子量约为30KDa。先前的研究发现，CacyBP/SIP能够与S100家族的部分蛋白呈Ca2+依赖性结合。CacyBP/SIP在神经组织中高表达，可能与神经分化有关。CacyBP/SIP还可与Siah-1、Skp1结合形成泛素连接酶复合物，参与β-catenin的降解，进而影响恶性肿瘤的发生发展。最新的研究发现，CacyBP/SIP还与阿尔茨海默病的发生发展有着较密切的联系。另外，研究发现CacyBP/SIP在神经细胞中有Ca2+依赖的核转位及磷酸化的现象。我们之前的实验发现，CacyBP/SIP在胃癌细胞中主要定位在胞浆，但是细胞内Ca2+的升高和PKC的激活均能使CacyBP/SIP发生核周及核转位，并且过表达CacyBP/SIP可以抑制肾癌及胃癌细胞的增殖。基因芯片显示，CacyBP/SIP可以下调细胞中cyclin B3和cyclin A1水平，因此，我们推测CacyBP/SIP是细胞周期调控分子,可能通过蛋白降解或其他途径影响细胞分裂周期，尤其是G2/M期。由于蛋白质分子在细胞的亚定位与其本身的功能发挥有着紧密的联系，所以本实验旨在研究CacyBP/SIP在细胞周期不同时期的亚细胞定位、蛋白表达、磷酸化水平的变化，并通过对CacyBP/SIP泛素连接酶复合物其他分子的定位及表达变化的观察，进而研究各分子之间相互作用的情况，揭示CacyBP/SIP对细胞周期可能的调控作用，为深入阐明CacyBP/SIP的抑癌机制奠定良好的基础。【目的】1、观察CacyBP/SIP在胃癌细胞SGC7901不同时期中亚细胞定位及蛋白表达情况。2、研究CacyBP/SIP不同时期的磷酸化水平。3、研究泛素连接酶复合物成员Siah-1、Skp1及CacyBP/SIP的配体S100A6在SGC7901不同时期中亚细胞定位及蛋白表达情况，检测Siah-1、Skp1与CacyBP/SIP的结合能力及β-catenin的表达变化。【方法】1、使用双thymidine阻滞法及nocodazole阻滞法使SGC7901细胞周期同步化，并利用流式细胞术检测阻滞效果。利用细胞免疫荧光染色技术观察CacyBP/SIP不同时期的亚细胞定位情况；提取不同时期的细胞总蛋白及核蛋白，利用Western blot技术检测CacyBP/SIP不同时期表达水平。2、利用免疫沉淀及Westernblot技术检测核内CacyBP/SIP在不同时期的磷酸化水平。3、利用细胞免疫荧光染色技术观察泛素连接酶复合物成员Siah-1、Skp1及CacyBP/SIP的配体S100A6在不同时期的亚细胞定位情况；利用Western blot技术检测它们在不同时期的表达水平；利用免疫沉淀及Western blot技术检测核内Siah-1、Skp1与CacyBP/SIP结合能力的变化；利用Western blot观察核内β-catenin在不同时期的表达变化。【结果】1、流式细胞术检测结果提示，经过双thymidine阻滞法进行细胞周期同步化后，大部分SGC7901细胞阻滞于G1/S期，撤药培养4h后，细胞进入S期。在8~12h，大多数细胞进入G2/M期，到16h时又重新回到G1期。经nocodazole阻滞法同步化细胞周期，在0h时细胞主要处于G2期，撤药培养2h、4h、6h后，细胞主要处于G1/S期。免疫荧光染色显示，在G1/S期时，CacyBP/SIP主要定位于胞浆，待细胞处于G2期时，则聚集于核周或入核。Western blot分析，在总蛋白水平，各时期CacyBP/SIP蛋白表达并无明显变化，而在核蛋白水平，G2期的CacyBP/SIP表达显著高于G1/S期。2、免疫沉淀及Western blot检测显示，G2期核CacyBP/SIP磷酸化水平显著高于G1/S期。3、为了研究CacyBP/SIP对细胞周期可能的调控机制，我们首先检测了CacyBP/SIP泛素连接酶复合物成员分子Siah-1、Skp1是否存在细胞周期相关的定位变化。免疫荧光染色显示，泛素连接酶复合物成员Siah-1、Skp1在G1/S期时，主要定位于胞浆，待细胞处于G2期时，发生核转位，与CacyBP/SIP的定位一致。对其蛋白水平进行Western blot分析，结果显示，不同细胞时期Siah-1、Skp1总蛋白表达并无明显变化，但G2期细胞的胞核中Siah-1、Skp1蛋白表达显著高于G1/S期细胞。同时，我们利用免疫沉淀及Western bolt检测了核中Siah-1、Skp1与CacyBP/SIP的结合能力，结果发现，在G2期，它们与CacyBP/SIP的结合能力显著高于以G1/S期。基于先前关于泛素连接酶复合物可以降解非磷酸化β-catenin蛋白的报道，我们检测了核内β-catenin在不同时期的表达，研究发现，其表达与泛素连接酶复合物的表达呈负相关。作为CacyBP/SIP的配体，S100A6蛋白在此期间的定位及蛋白表达均无明显变化。【结论】1、CacyBP/SIP在胃癌细胞SGC7901中存在细胞周期依赖性核转位现象，在G1/S期，其主要分布于胞浆，G2期时发生核周及核转位，并且发生了磷酸化，提示其活性可能发生了变化。2、与CacyBP/SIP类似，泛素连接酶复合物成员Siah-1、Skp1也发生G2期依赖性核转位，且在转位时与CacyBP/SIP的结合能力升高，提示此三者在G2期入核时结合形成泛素连接酶复合物，而胞核中β-catenin的表达降低，间接提示泛素连接酶复合物的活性增强。