FAM134B调控的内质网自噬在无镁外液致痫海马神经元内质网应激和凋亡中的作用及机制研究

来源 :郑州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:teddycici
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目的:
  癫痫是最常见的神经系统疾病之一,其具有反复性及发作性的特征。癫痫不仅危害患者的身体,而且在一定程度上影响患者的心理及精神,大大降低了患者的生活质量。尽管目前的抗癫痫药物可以有效地控制多数患者的癫痫发作,但仍有近30%的癫痫患者对药物治疗无效。因此,我们迫切需要为癫痫患者寻找新的治疗靶点。
  内质网(Endoplasmic Reticulum,ER)是蛋白质合成、折叠和修饰、钙储存和脂质合成的重要细胞器。细胞内营养缺乏、钙离子(Calcium,Ca2+)代谢紊乱及持续的氧化应激等刺激会破坏细胞的稳态。为了维持细胞生存,ER应激等一系列细胞自我保护事件将被启动。ER应激可引起未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR),UPR通过激活肌醇需要蛋白1(Inositol-requiring protein1,IRE1)、蛋白激酶样ER激酶(Protein kinase RNA-like ER kinase,PERK)和激活转录因子(Activating transcription factor6,ATF6)进一步促进蛋白的表达,帮助错误折叠和未折叠的蛋白恢复正常结构。适度的UPR可缓解细胞功能障碍,但持续的ER应激或UPR不能恢复ER稳态时,将触发细胞凋亡,导致细胞死亡。ER应激已被证明与癫痫神经损伤有关,因此及时清除受损的ER及未折叠和错误折叠的蛋白,避免过度的ER应激,对维持细胞内稳态至关重要并为癫痫的治疗提供了新的治疗思路。
  自噬是一种由应激引起的细胞降解过程,通过降解聚集蛋白、未折叠/错折叠蛋白或受损的细胞器来恢复代谢稳态。越来越多的研究表明ER应激会引发自噬。在ER应激发生时,自噬能够有效清除细胞内受损的ER,降解蛋白聚体,缓解ER应激,从而减少细胞凋亡。但是过度的自噬会破坏细胞内蛋白质和细胞器并在细胞死亡中发挥作用,因此自噬对ER稳态的维持以及细胞生存至关重要。FAM134B(Family with Sequence Similarity134,Member B)基因又称RETREG1,其编码的FAM134B蛋白是位于ER的跨膜受体蛋白,是首个被识别的介导ER自噬的受体。FAM134B蛋白包含LC3相互作用区域(LC3-interacting region,LIR)和ER蛋白同源结构域(Reticulon-homology Domain,RHD),通过LIR与MAP1LC3B的特异性结合,形成ER自噬靶向降解ER片段。由此可见FAM134B蛋白介导的ER自噬可降解多余的ER膜,维持细胞稳态,并在多种疾病的病理生理过程中发挥重要作用。我们前期研究发现癫痫大鼠海马FAM134B表达和自噬水平均明显升高,但是FAM134B在癫痫神经损伤中的作用及机制仍然未知。
  在本研究中,我们通过体外培养海马神经元,利用无镁细胞外液构建体外癫痫模型,并构建慢病毒真核表达载体干预FAM134B表达,通过检测ER应激相关蛋白的表达及细胞凋亡等情况,探讨其对ER应激以及细胞凋亡的影响,并利用选择性自噬抑制剂(3-methyladenine,3-MA)进一步研究其可能的机制。
  材料与方法:
  用异氟醚麻醉新生健康Sprague-Dawley大鼠,断头处死,用70%的乙醇消毒头部,解剖头骨上方的皮肤,露出头骨.将剪刀插入椎管,小心地向前切开头骨的一侧,避免损伤大脑。用镊子夹住颅底,抬起并向前露出大脑,轻轻将大脑从颅骨中取出,转移到解剖盘中。快速分离海马组织,剥离所有残留的脑膜,用镊子将海马体放入盛有磷酸盐缓冲液(phosphate buffer,PBS)的冰盘中。将组织移入含有2ml DMEM和2ml胰酶的6cm培养皿中,在37℃孵育15min,然后将组织转移到含有2ml种植培养基的15ml试管中,用巴斯德移液管反复吹打10次,静置2min后,将上清液转移到新的15ml试管中。用2ml的种植培养基重新悬浮第一根试管中的沉淀物。重复上述步骤两次以上,将每次的上清液混合,产生约6ml悬浮细胞,根据需要调整细胞浓度并种植于培养板上,并进行神经元纯度检测。培养10d后,细胞随机分为CON组、AE组、lenti-pGv组(Nc组)、lenti-FAM134B组(Lv-FAM134B组)和lenti-FAM134B-shRNA组(sh-FAM134B组),CON组和AE组分别用正常细胞外液及无镁溶液处理3h后用维持培养基培养,lenti-pGv组、lenti-FAM134B组和lenti-FAM134B-shRNA组在无镁溶液处理前分别用lenti-pGv、lenti-FAM134B及lenti-FAM134B-shRNA处理。通过MTT法检测细胞活力、TUNEL法检测细胞凋亡情况、荧光探针标记检测ER Ca2+浓度及细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、Western Blot法检测GRP78、CHOP表达及LC3-II/LC3-I比值的变化、免疫荧光共定位检测FAM134B和LC3的表达。此外,我们用选择性自噬抑制剂3-MA研究FAM134B在癫痫海马神经元中的作用机制。
  统计分析采用SP SS17.0软件,结果以均数±标准差表示。通过单因素方差分析和LSD-t检验分析数据的统计学意义,p≤0.05为差异有统计学意义。
  结果:
  1、海马神经元形态学特征及纯度检测:在显微镜下观察培养至第7d的海马神经元,其胞体立体感强,可清楚地观察到树突及轴突。此外,采用免疫荧光法检测神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE),确定神经元纯度高于95%。
  2、慢病毒载体感染效率检测:通过Western blot法检测FAM134B的表达,分析慢病毒载体的感染效率。与AE组相比,lenti-FAM134B组FAM134B表达明显升高,而lenti-FAM134B-shRNA组FAM134B表达明显降低。lenti-pGv组(Nc组)与AE组相比无统计学差异。
  3、MTT比色法检测细胞活力:与CON组相比,AE组神经元活力降低;与AE组相比,lenti-FAM134B组海马神经元活力明显升高,而lenti-FAM134B-shRNA组则降低。AE组与lenti-pGV组(Nc组)比较,差异无统计学意义。
  4、TUNEL染色法检测细胞凋亡:AE组细胞凋亡数增加;与AE组相比,lenti-FAM134B组细胞凋亡数明显降低,而lenti-FAM134B-shRNA组则增加。AE组与lenti-pGV组(Nc组)比较,差异无统计学意义。
  5、ER Ca2+及细胞ROS测定:与CON组相比,AE组ER Ca2+浓度降低,而细胞ROS水平升高;与AE组相比,lenti-FAM134B组ER Ca2+浓度升高,细胞ROS水平降低,而lenti-FAM134B-shRNA组则发挥相反作用。AE组与lenti-pGV组(Nc组)比较,差异无统计学意义。
  6、Western blot检测:与CON组相比,AE组GRP78、CHOP的表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显增加;与AE组相比,lenti-FAM134B组GRP78、CHOP的表达降低、LC3-II/LC3-I比值明显增加,而lenti-FAM134B-shRNA组则发挥相反作用。AE组与lenti-pGV组(Nc组)比较,差异无统计学意义。
  7、免疫荧光共定位:与CON组相比,AE组LC3B和FAM134B共定位明显增加;与AE组相比,lenti-FAM134B组LC3B和FAM134B共定位明显增加,而lenti-FAM134B-shRNA组则降低。AE组与lenti-pGV组(Nc组)比较,差异无统计学意义。
  8、3-MA预处理显著抵消了FAM134B对ER应激和神经元凋亡的影响。
  结论:
  1.FAM134B可减轻癫痫诱导的ER应激和海马神经元凋亡。
  2.ER自噬可能在FAM134B参与癫痫神经元凋亡中起重要作用。
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