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目的:通过建立IRE1α(inositol-requiring enzyme 1)沉默的大鼠正常肝细胞BRL(buffalo rat liver)细胞的稳定细胞株,并建立肠外营养相关性肝病(Parenteral nutrition-associated liver disease,PNALD)细胞模型——肝细胞脂肪变模型,研究内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)中IRE1α/XBP1s信号通路相关分子IRE1α、XBP1s、JNK的表达,进一步深入探讨ERS时IRE1α/XBP1s信号通路在PNALD发病机制中的作用,为临床预防和治疗PNALD提供新思路和实验依据。材料与方法:1.慢病毒颗粒的制备及干扰效果最佳的慢病毒颗粒的筛选:培养293T细胞,将慢病毒包装质粒ps PAX2和包膜表达质粒p MD2.G与干扰表达载体质粒GV248-IRE1a、GV248-IRE1b、GV248-IRE1c和阴性对照表达载体质粒GV248-CON组合成三质粒慢病毒表达系统,Lipofectamine2000分别将其共转染至包装细胞(293T细胞),命名为LV-IRE1a、LV-IRE1b、LV-IRE1c和LV-CON,感染293T细胞,Western blot检测IRE1α的表达效果,筛选出干扰效果最佳的慢病毒组。2.IRE1α沉默的稳定细胞株的筛选:培养大鼠正常肝细胞BRL细胞,用不同浓度的嘌呤霉素处理细胞,2~3天细胞全部死亡的嘌呤霉素最小浓度,即确定为嘌呤霉素的最佳筛选浓度;用已筛选的干扰效果最佳的干扰慢病毒和阴性对照慢病毒感染BRL细胞72小时,用最佳浓度嘌呤霉素处理BRL细胞,每三天更换含有嘌呤霉素的完全培养基,直至未感染慢病毒的空白组细胞全部死亡。扩增培养慢病毒感染的两组BRL细胞。3.脂肪乳最佳诱导浓度的筛选:培养大鼠BRL细胞,对照组用正常培养基培养肝细胞,实验组用加入培养基稀释的不同浓度医用脂肪乳(浓度分别为0.2%、0.4%、0.6%、1%、2%、4%)诱导大鼠BRL细胞24、48小时,油红O染色观察各组细胞形态和脂滴形成情况,CCK-8检测各组细胞增殖,确定脂肪乳最佳诱导浓度。4.实验分组:随机分为正常BRL组(NC组)、豆油脂肪乳BRL组(SO组)、LV-干扰豆油脂肪乳组(LV-IRE1α组)和LV-阴性对照脂肪乳组(LV-CON组)。除NC组外,其余三组均以最佳诱导浓度为0.6%脂肪乳培养。在不同时间点(12h、24h、48h),通过油红O染色激光共聚焦显微镜观察肝细胞脂肪变情况;全自动生化仪检测各时间点(12h、24h、48h)细胞培养液生化指标变化;分别用RT-PCR和Western Blot方法检测IRE1α/XBP1s中相关分子IRE1α、XBP1s、JNK m RNA和蛋白的表达。结果:1.慢病毒颗粒的制备及干扰效果最佳的慢病毒颗粒的筛选:成功包装四种慢病毒颗粒(LV-IRE1a、LV-IRE1b、LV-IRE1c和LV-CON),感染BRL细胞,并筛选出干扰效果最佳的慢病毒组为LV-IRE1b组。筛选出嘌呤霉素处理BRL细胞的最小浓度为0.8μg/m L,并且建立了IRE1α沉默的稳定细胞株。2.肝细胞脂肪变造模脂肪乳浓度确定:2.1不同浓度脂肪乳培养肝细胞后形态观察正常BRL肝细胞形态正常,细胞间结合紧密,细胞内未见红色脂滴,而不同浓度脂肪乳培养肝细胞,0.2%浓度组肝细胞在24、48h两时间点形态正常、细胞间结合紧密、胞内未见红色脂滴,0.4%、0.6%浓度组细胞形态尚正常、细胞间结合尚紧密、胞浆内可见红色空泡脂滴,且随脂肪乳浓度的增加及培养时间延长脂滴增多。1%、2%和4%浓度组培养24、48h时,细胞肿胀,死亡细胞较多,胞内红色脂滴明显增多。2.2不同浓度脂肪乳培养肝细胞后活力观察CCK-8检测细胞增殖OD值:用0.6%及以下浓度脂肪乳培养肝细胞,24、48h细胞OD值与正常组比较均无明显差异(P>0.05);而1%、2%及4%浓度脂肪乳培养肝细胞24、48h后,细胞活性OD值明显低于对照组(P<0.05),肝细胞虽有明显脂肪变,但不能进行后续实验,结合培养后肝细胞形态和细胞增殖情况,选取0.6%脂肪乳作为最佳诱导浓度。3.造模后四组肝细胞形态改变:NC组:4个时间点(0、12、24、48h)肝细胞形态正常,细胞间结合紧密,细胞内未见红色脂滴。SO组和LV-CON组:培养12h肝细胞形态正常,细胞间结合紧密,胞内少许脂肪滴;培养24h开始出现细胞轮廓变化,细胞间结合欠紧密,脂肪滴增多;培养48h,出现细胞肿胀,胞内红色脂滴逐渐增多。LV-IRE1α组:培养12h细胞形态正常,细胞间结合紧密,胞内少许脂肪滴;培养24h、48h细胞形态改变、肿胀,细胞间结合欠紧密,细胞内脂肪滴明显、聚集成团。4.细胞培养上清液生化指标变化:四组组间及组内在三个时间点(12h、24h、48h)ALT、AST均有显著差异,LDH在两个时间点(24h、48h)组间及组内有统计学意义(P<0.05),而ALP、GGT均无明显差异(P>0.05);SO组、LV-CON组、LV-IRE1组三个时间点TBIL、DBIL、AST、ALT、TG显著高于NC组,随造模时间延长而升高,且组内12h、24h、48h三个时间点比较均有统计学意义(P<0.05),LDH在24、48h均显著高于NC组(P<0.05);LV-IRE1组三个时间点AST、ALT、LDH显著高于SO组和LV-CON组(P<0.05),48h ALB显著低于其余三组(P<0.05)。5.四组大鼠BRL细胞中IRE1α/XBP1s/JNK m RNA的表达变化:5.1四组肝细胞不同时间点IRE1αm RNA的动态表达四组间不同时间点(12、24、48h)肝细胞IRE1αm RNA的表达均有显著差异(均P<0.05)。SO组与LV-CON组两组间不同时间点IRE1αm RNA表达均无明显差异(均P>0.05)。与NC组相比,SO组和LV-CON组在12、24、48h三个时间点IRE1αm RNA表达均显著升高(均P<0.05),而LV-IRE1α组IRE1αm RNA表达降低(P<0.05);SO组、LV-CON组IRE1αm RNA两组组内不同时间点间表达有显著差异,均自12h起升高、24h达高峰(均P<0.05),48h下降,但较24h无显著差异(P>0.05)。5.2四组肝细胞不同时间点XBP1s m RNA的动态表达四组间不同时间点(12、24、48h)肝细胞XBP1s m RNA的表达均有显著差异(均P<0.05)。SO组、LV-CON组两组间不同时间点XBP1s m RNA的表达均无明显差异(均P>0.05)。与NC组相比,SO组及LV-CON组XBP1s m RNA表达在12、24、48h三个时间点的表达均显著升高(P<0.05),LV-IRE1α组XBP1s m RNA三个时间点均低于NC组(P<0.05);NC组、LV-IRE1α组组内三个时间点无差异(P>0.05);SO组、LV-CON组内比较均自12h起升高,24h达高峰,48h相比24h下降,有统计学意义(P<0.05)。5.3四组大鼠BRL细胞中JNK m RNA的动态表达四组间三个时间点(12h、24h、48h)细胞JNK m RNA表达有统计学意义(P<0.05)。SO组与LV-CON组组间不同时间点JNK m RNA基因表达均无显著差异(P>0.05)。与NC组相比,SO组、LV-CON两组JNK m RNA表达12h无明显统计学意义(P>0.05),而24h、48h两时间点JNK m RNA表达则明显升高(P<0.05);LV-IRE1α组12h、24h JNK m RNA表达低于NC组,差异有统计学意义(P<0.05),48h明显高于NC组(P<0.05);SO组、LV-CON组、LV-IRE1α组三组组内自12h开始逐渐升高,48h达高峰,差异有统计学意义(P<0.05)。6.24h四组大鼠肝细胞中P-IRE1α/XBP1s/JNK的蛋白表达水平比较6.1 24h四组大鼠肝细胞中P-IRE1α的蛋白表达水平比较:24h细胞P-IRE1α蛋白表达在四组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)。与NC组相比,SO组、LV-CON组P-IRE1α蛋白表达明显升高差异有统计学意义(P<0.05),而LV-IRE1α组明显降低(P<0.05);SO组、LV-CON组两组间则无显著差异(P>0.05);与LV-IRE1α组相比,SO组与LV-CON组两组P-IRE1α蛋白表达明显升高(P<0.05)。6.2 24h四组大鼠肝细胞中XBP1s的蛋白表达水平比较:24h细胞XBP1s蛋白表达在四组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)。与NC组相比,SO组、LV-CON组XBP1s蛋白表达均显著升高(P<0.05);SO组、LV-CON组两组间则无显著差异(P>0.05);LV-IRE1α组XBP1s蛋白表达较NC组升高,较SO组、LV-CON组低(P<0.05)。6.3 24h四组大鼠肝细胞中JNK、P-JNK的蛋白表达水平比较:24h细胞JNK、p-JNK蛋白表达在四组之间比较差异均无统计学意义(P<0.05);SO组、LV-IRE1组、LV-CON组JNK和P-JNK蛋白两两比较均无明显差异(P>0.05),但均明显高于NC组(P<0.05)。结论:1、本实验成功包装出IRE1α干扰的慢病毒,成功感染BRL细胞;2、本实验通过不同浓度脂肪乳诱导大鼠BRL细胞,筛选出实验造模的最适脂肪乳浓度,为进一步开展后续实验研究奠定基础;3、本实验成功建立了PNALD细胞模型——肝细胞脂肪变模型,为进一步研究其发病机制奠定了基础;4、SO组肝细胞中IRE1α/XBP1s/JNK信号通路中相关分子IRE1α、XBP1s m RNA表达在12h、24h升高,48h下降,JNK m RNA表达随造模时间延长逐渐升高,P-IRE1α、XBP1s蛋白表达在24h升高;LV-IRE1α组相关分子IRE1α、XBP1s m RNA和P-IRE1α、XBP1s蛋白表达在12、24h明显下降,JNK m RNA和P-JNK蛋白在24h明显升高。提示ERS时IRE1α/XBP1s/JNK信号通路可能参与了PNALD肝细胞脂肪变的发生、发展。