背景结直肠癌是最常见的消化道肿瘤之一,结直肠癌患者实行了根治性手术后,仍会有相当一部分的患者不可避免的出现复发,术后5年生存率一直徘徊在45%-55%之间。细胞角蛋白20 (cytokertin20,CK20)是分布于外胚层起源细胞中的中间纤维丝,为细胞骨架的组成部分之一。CK20具有更为严格的上皮组织特异性。正常组织中,CK20见于肠粘膜细胞,胃粘膜及幽门腺体细胞,十二指肠粘膜细胞,泌尿系伞状细胞,表皮M erkel细胞,而其它组织均为阴性。CK20在细胞发生化生、恶变、肿瘤转移、体外培养等异常时,这种表达持续存在。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)是一种重要的肿瘤相关抗原和国际公认的肿瘤标记物,相对分子质量为180,000的胚胎性癌蛋自,广泛地存在于上皮源性恶性肿瘤组织中,在90%的胃肠道癌,60%的胰腺癌、50%的乳腺癌,70%的非小细胞肺癌中有较高的表达。目的对CEA和CK20在结直肠癌不同组织的表达及它们之间的关系做出初步研究,探讨两者与结直肠癌临床和病理之间的关系。方法采用免疫组织化学法分别检测CEA和CK20蛋白在结直肠癌患者的癌组织、癌旁组织、肠系膜淋巴结组织及正常肠粘膜组织中的表达。结果CEA和CK20蛋白在组织中的表达定位于细胞浆和细胞膜。除正常对照组为阴性外其余各组CEA蛋白均呈不同程度的表达。CEA在癌组织中的总阳性表达率为92.86%；癌旁组织组CEA的表达高于肠系膜淋巴结组。包括正常对照组在内各组CK20蛋白均有不同程度的表达,癌组织组CK20的表达高于癌旁组织组,癌旁组织组的表达高于正常对照组的表达,正常对照组的表达高于肠系膜淋巴结组。结论1、CEA在各种不同结直肠癌组织中均有不同程度的表达,正常结肠粘膜无表达。其在癌组织中的表达与肿瘤的Dukes分期有关。2、CK20在正常结肠粘膜及结直肠癌组织中均有不同程度的表达,其在癌组织中的表达与有无淋巴结转移有关。背景结直肠癌出现转移和复发与肿瘤的隐性微转移(occult micrometastases)及循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCS)密切相关,目前常用检测CTCS的技术有免疫细胞化学法、逆转录聚合酶链反应、流式细胞术等方法。由于这些方法或较费时、或程序复杂、或检查结果假阳性率高,难以推广应用于临床。已经出现一些新的方法,如实时荧光定量PCR、蛋白指纹图谱技术等。但以上的方法实验成本较高,目前还难以适应临床的实际需要,近年来,免疫传感器分析法由于其灵敏度高、选择性好和结构简单等特点而得到了越来越广泛的重视。免疫传感器是基于检测抗原-抗体结合的一种高选择性生物传感器。本实验首次采用免疫传感器分析法检测结直肠癌患者血清中CEA、CK20的表达。目的初步探讨准确性、特异性高且简便实用的CEA、CK20检测方法以期改善结直肠癌诊断及预后评估。方法分别采用酶联免疫法、实时荧光定量PCR及免疫传感器分析法序列性联合检测结直肠癌患者不同组织及外周血中CEA及CK20的表达,以探讨其在结直肠癌的诊断及预后评估中的价值。结果实时荧光定量PCR技术结合免疫传感器及ELISA等方法对结直肠癌患者外周血CEA、CK20及不同组织CEAmRNA、CK20mRNA进行检测发现：采用灵敏度较高的realtime-PCR有利于提高基因检测阳性率,尤其是外周血CEAmRNA的阳性率从57.14%提高到89.28%；Dukes A, B期的15例患者中,通过CK20的免疫组化染色发现有3例患者(74个淋巴结)有微转移,进一步检测CK20mRNA的拷贝表达发现有9例患者(155个淋巴结)有微转移；CEA和CK20免疫传感器应用于临床标本的检测结果与ELISA法比较无显著性差异,尽管灵敏度和准确性不及realtime-PCR,但特异性要强于realtime-PCR,且其阳性率还高于ELISA法,CEA和CK20免疫传感器能用于血清CEA的定量检测。结论一、改进检测方法能提高结直肠癌患者外周血CEA、CK20的阳性率,能为诊断及预后评估提供帮助。二、realtime-PCR检测肠系膜淋巴结CK20mRNA的表达对确定结直肠癌患者的分期有重要的价值,对预后的评估也有一定意义。三、首次成功建立CEA、CK20的多巴胺化学氧化原位包埋法免疫传感器,并应用于检测结直肠癌患者外周血CEA、CK20。背景决定结直肠癌患者预后的最重要指标是肿瘤的浸润深度与淋巴结转移的程度。但是,在部分实施了根治性手术的结直肠癌患者中,经病理学常规检查未发现淋巴结转移者仍会发生转移和复发,有研究认为该现象与结直肠癌淋巴结微转移有关。1992年UICC将隐匿性转移(occult metastasis)或微转移(micrometastasis, MM)限定为单个转移肿瘤细胞或转移肿瘤细胞团直径<2 mm。多数文献报告将常规组织学检查未发现转移灶而经免疫组化或分子生物学技术检测发现的淋巴结转移灶定义为淋巴结微转移。因此,淋巴结微转移目前尚无统一的标准。本研究的前面两部分实验已经证明采用免疫组化、ELISA、免疫传感器、realtime-PCR等方法检测结直肠癌患者外周血及肠系膜淋巴结中CEA、CK20及CEAmRNA、CK20mRNA,结果发现循环血液微转移灶及淋巴结微转移灶。目的探讨CEA、CK20以及CEAmRNA和CK20mRNA与微转移的关系,了解其能否成为结直肠癌分期及预后评估的有效方法。方法通过临床随访及临床应用统计学方法对两组测定值进行比较分析。结果影响预后的指标有：外周血CK20阳性率、淋巴结CK20mRNA阳性率、淋巴结CEAmRNA阳性率、术前合并梗阻或穿孔、糖尿病、肿瘤浸润深度、下切缘与肿瘤距离、送检淋巴结数目、有无淋巴结转移、术后有无化疗(p<0.05)。其中淋巴结CK20mRNA阳性率、淋巴结CEAmRNA阳性率、术前合并梗阻或穿孔、肿瘤浸润深度、下切缘与肿瘤距离是影响结直肠癌预后的独立因素,而外周血CK20阳性率、术后有无化疗、糖尿病、送检淋巴结数目则未能进入Cox多因素模型。结论采用realtime-PCR的方法检测肠系膜淋巴结的CK20mRNA表达在结直肠癌诊断及预后评估中有一定的意义和价值。