目的:本实验对兔视网膜Müller细胞进行体外分离培养,模拟体内高血糖、高胰岛素血症微环境,观察兔视网膜Müller细胞的生长变化,利用高碘酸-Schiff(PAS)反应、激光共聚焦显微镜结合荧光免疫细胞化学染色法,对在不同浓度的葡萄糖或胰岛素的作用下兔视网膜Müller细胞的糖原、糖原合成酶(GS)及葡萄糖转运蛋白-1(GLUT-1)进行定位、半定量分析,观察Müller细胞摄糖、糖原合成及储糖情况变化,深入探讨发生在高血糖、高胰岛素血症中Müller细胞的糖原合成功能、为神经细胞提供能量及营养、调节视网膜谷氨酸浓度等作用的影响。方法:使用组织块贴壁培养法培养兔视网膜Müller细胞;通过相差显微镜、HE染色、荧光免疫技术、电镜观察其形态特征及特殊的免疫标记物进行细胞身份鉴定和纯度的评估。分别在不同浓度葡萄糖、胰岛素培养条件下,通过MTT法测定Müller细胞的生长活性的变化;采用高碘酸-Schiff反应试验对Müller细胞胞内的多糖染色,通过图像分析软件测定其平均光密度值,分析不同条件作用下其胞内多糖含量的变化;采用荧光免疫技术,对Müller细胞胞内的GLUT-1及GS进行荧光标记,通过图像分析软件测定平均光密度值观察Müller细胞的GLUT-1及GS表达的变化。统计学分析:采用SPSS11.0统计软件进行分析,所有数据以均数±标准差(x—±S)表示,每个时间点及毎种条件培养组中的小组均数比较采用单因素方差分析,两个时间点及两种条件培养组间总体差异采用随机区组设计资料的方差分析,ɑ<0.05有统计学意义。结果:(一)、通过使用组织块培养法培养Müller细胞,培养2-3d后,组织块周围即可见有部分细胞突起伸出,第7d可见组织块周围呈放射状长满细胞,约3周后,可见细胞几乎铺满整个瓶底;电镜下可见Müller细胞胞浆内含有丰富8~10 nm微丝的特异性超微结构;荧光免疫标记见兔视网膜Müller细胞CRALBP、GFAP呈绿色和红色荧光标记,二者阳性率均95%以上;(二)、高浓度葡萄糖培养条件下培养时间为1d时可明显刺激Müller细胞生长,上调GLUT-1及GS的表达,加强Müller细胞摄糖、合成糖原功能,使细胞内糖原含量明显增加;但随着培养时间的延长,高浓度葡萄糖培养条件下见细胞折光增加,部分细胞突起出现回缩现象,其测得的OD值随培养时间延长及浓度升高呈逐渐下降趋势,培养时间为3d时GLUT-1表达增加,但GS表达呈下降,胞内糖原含量较正常明显增加,较培养时间为1d仍有增加趋势,当培养时间为5d时,50mmol/L葡萄糖组内见部分漂浮的失活细胞,下方贴壁细胞部分出现溶解现象,此时所测得细胞活力明显下降,细胞内糖堆积现象严重,其GLUT-1及GS表达下降明显;(三)、胰岛素在培养时间为1d,可刺激兔视网膜Müller细胞上调GLUT-1及GS的表达,胞内的糖原含量明显增加,其中胰岛素浓度为4U/ml的糖含量最多;培养3d后,胰岛素则表现出对Müller细胞生长活力的抑制作用,细胞折光增加,突起回缩,较高浓度胰岛素组内可见较多漂浮失活的细胞,GLUT-1、GS在胰岛素浓度为1、4U/ml表达增加,但胰岛素浓度为8、12U/ml时表达呈下降;培养5d时,胰岛素兔视网膜Müller细胞的影响更为明显,各组内均可见漂浮失活细胞,测得的活性较正常均有明显下降,而此时胰岛素浓度为1、4U/ml组内GLUT-1、GS表达仍较正常组增加,较培养时间为3d减少,胞内糖原含量增加最为明显亦是胰岛素浓度为1、4U/ml组。结论:(一)、使用组织块贴壁法可培养出兔视网膜Müller细胞,纯度达95%以上;(二)、高浓度葡萄糖早期可明显刺激Müller细胞生长,上调GLUT-1及GS的表达,加强Müller细胞摄糖、合成糖原功能,使细胞内糖原含量明显增加;但随作用时间延长,对细胞生长、GLUT-1、GS表达均起着抑制作用,并与葡萄糖浓度存在密切相关性,随着浓度的增加抑制作用越强。因此,当视网膜Müller细胞长期处于高血糖环境中,细胞生长受到影响,凋亡增加,其摄糖、合成糖原功能明显受限;(三)、胰岛素早期亦明显刺激Müller细胞生长,上调GLUT-1及GS的表达,加强Müller细胞摄糖、合成糖原功能,使细胞内糖原含量明显增加;亦随作用时间延长,对细胞生长、GLUT-1、GS表达均起着抑制作用,并与浓度存在密切相关性。但与高浓度葡萄糖组对比,胰岛素对Müller细胞生长抑制作用更明显,作用时间超过3d后,即可见较多漂浮失活细胞,故胰岛素一方面不但使Müller细胞处于失代偿状态下,细胞的摄糖、合成糖原及储糖的功能均受到抑制,影响其在视网膜中应发挥的各种生理功能,另一方面胰岛素可显著抑制Müller细胞生长,并促进大量视网膜Müller细胞死亡,因此我们认为高胰岛素血症加速DR进展,与高浓度胰岛素对视网膜Müller细胞的毒性作用密切相关。