目的:肿瘤的多药耐药(multidrug resistance,MDR)是癌症化疗失败的重要原因,出现MDR的一类主要机制在于磷酸腺苷ATP的结合盒—ABC转运蛋白的过度表达,ABC转运蛋白可以增加癌细胞中药物的流出,从而减少细胞内药物浓度,产生MDR。研究肿瘤MDR逆转剂有望找到克服耐药的方法,减少癌症复发,提高治疗效果,改善患者生活质量。近些年开发的MDR逆转剂的化学药物大部分是P-gp抑制剂,通过抑制P-gp的转运活性或者与化疗药物竞争结合P-gp的底物结合位点来抑制其功能,从而增加化疗药物在肿瘤细胞内的积蓄,逆转肿瘤MDR。但是耐药逆转的研究多数停留在体外研究阶段,目前的耐药逆转剂常因其特异性低以及副作用大使其临床应用受到明显限制,因此寻找低毒有效的MDR逆转剂是治疗肿瘤的有效而长期的探索过程。伐地那非作为新一代磷酸二酯酶5(PDE5)抑制剂口服吸收好,安全性高,在转染MRP7的HEK293细胞上,这类药物可以增强对化疗药物的敏感性,但其其逆转耐药的作用及机制尚有许多未解之处。乳腺癌是妇女中发病率较高的恶性肿瘤。本研究在人乳腺癌细胞株MCF-7/ADR上探讨PDE5抑制剂伐地那非的逆转耐药作用,并进一步在整体荷瘤动物模型上研究其耐药作用。方法:1采用MTT法检测伐地那非、西地那非、他达拉非联合阿霉素对人乳腺癌MCF-7/ADR细胞增殖的影响。2采用Hoechst 33342染色检测伐地那非联合阿霉素对人乳腺癌MFC-7/ADR细胞凋亡的影响。3采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测伐地那非对阿霉素在MFC-7/ADR细胞中积累和分布的影响。4高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)检测伐地那非对阿霉素在MCF-7/ADR细胞不同部位含量的影响。5 Western Blot实验检测伐地那非对MCF-7/ADR细胞p-gp、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase 3蛋白表达的影响。6建立balb/cnude小鼠乳腺癌耐药模型,研究伐地那非逆转荷瘤小鼠阿霉素耐药的体内药效学作用。分组给药后,测量肿瘤生长速度,并检测相关蛋白表达变化。结果:1伐地那非、西地那非和他达拉非逆转mcf-7/adr细胞阿霉素耐药的作用单独给予阿霉素和伐地那非、西地那非或他达拉非时,mcf-7/adr细胞的生长作用未受明显抑制。但二者合用可显著提高细胞对阿霉素的敏感性,联合给予阿霉素和伐地那非、西地那非或他达拉非均能显著抑制mcf-7/adr细胞生长,且随着伐地那非、西地那非或他达拉非浓度的增加,逆转阿霉素耐药的作用明显增强,对细胞生长的抑制率显著提高。三种药物相比较,以伐地那非逆转mcf-7/adr细胞阿霉素耐药的作用最强。2伐地那非联用阿霉素对mcf-7/adr细胞凋亡的影响正常组细胞的细胞核被染成弥散均匀的蓝色,呈圆形。单独使用阿霉素或者伐地那非后,细胞核形态、荧光强度与对照组相比无明显差异,均未出现细胞核浓缩等凋亡细胞特有的变化。伐地那非联合阿霉素作用后,能引起mcf-7/adr细胞的细胞核呈现明显的凋亡特征,细胞核染色质浓缩,边聚,形成新月状。3激光共聚焦显微镜检测药物对mcf-7/adr细胞内阿霉素含量以及分布的影响对照组和伐地那非组未显示明显的荧光,给药6h后阿霉素组和联合用药组可看到明显的荧光。伐地那非和阿霉素联合用药组的荧光强度明显高于阿霉素单独用药组。将阿霉素的红色荧光与细胞核的蓝色荧光,以及与线粒体的绿色荧光merge的结果显示,阿霉素在细胞核和线粒体均有明显的分布。4hplc-ms检测伐地那非对细胞内阿霉素分布的影响伐地那非可显著提高细胞核,细胞浆和线粒体中阿霉素的浓度,其中细胞核中阿霉素的浓度最高,其次是细胞浆和线粒体。在细胞核中,每个时间点联合用药组阿霉素的含量均比单独阿霉素组要高,且随着给药时间增加,联合用药组细胞核中阿霉素的含量逐渐增高。在细胞浆中,各时间点的检测结果显示,与单独给药组相比,伐地那非联合用药组阿霉素的含量都呈显著性增加,6h时,联合用药组细胞浆阿霉素含量最高。线粒体中阿霉素的含量较细胞核和细胞浆低,2h时,联合用药组的阿霉素含量与单独使用阿霉素组相比并未显著性增加,6h和12h时,联合用药组的阿霉素含量较阿霉素单独用药组明显增加,但12h时较6h时阿霉素的含量有所降低。5药物对mcf-7/adr细胞凋亡相关蛋白p-gp、bcl-2、bax和cleaved-caspase3蛋白表达的影响与对照组相比较,阿霉素单独用药组和伐地那非组bax/bcl-2比值没有显著性变化,阿霉素和伐地那非联合用药组的bax/bcl-2比值显著升高。对照组、阿霉素组、伐地那非组和联合用药组之间p-gp的表达没有显著性变化。对照组、阿霉素组、伐地那非组没有cleaved-caspase3蛋白表达,在联合用药组,可看到cleaved-caspase3蛋白表达明显升高。6伐地那非联合阿霉素治疗mcf-7/adr荷瘤鼠的药效学评价连续给予耐药乳腺癌mcf-7/adr小鼠药物35天,称量体重,并记录肿瘤生长曲线。与对照组相比,阿霉素单独用药组以及联合用药组体重有所减轻,伐地那非组小鼠体重没有明显变化。与对照组比较,阿霉素单独用药组和伐地那非组肿瘤生长速度没有显著性差异,联合用药组肿瘤生长速度显著降低。与对照组相比,联合用药组bax/bcl-2比值显著升高,其他组没有明显变化。各组之间p-gp的表达没有显著性变化。在联合用药组,可看到cleaved-caspase3蛋白表达明显升高。结论:1伐地那非,西地那非,他达拉非和阿霉素单独给药则不影响细胞增殖,合用后可能明显逆转mcf-7/adr细胞对阿霉素的耐药作用,增强细胞对阿霉素的敏感性,以伐地那非作用最为明显。2伐地那非可增加阿霉素在细胞核,细胞浆和线粒体的含量,尤其是细胞核中的含量增加最为明显,3在荷瘤裸鼠模型上,与单独用药组相比,伐地那非与阿霉素联用组肿瘤生长缓慢,肿瘤体积较小。4伐地那非和阿霉素合用可诱导mcf-7/adr细胞凋亡,增加凋亡蛋白表达,但对p-gp表达没有影响。