低丰度蛋白质电化学定量新方法研究

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蛋白质作为生物学功能的直接承担者,其含量变化与生命活动息息相关。因此,对蛋白质的定量检测在基础生物科学研究和临床诊断应用等方面具有十分重要的意义。然而,许多蛋白质,尤其是疾病标志蛋白在生物体内的含量极低,达到痕量甚至超痕量的水平,现有的蛋白质定量分析手段往往无能为力,因此,为了能够对这些低丰度的蛋白质进行定量检测,急需发展非常灵敏的蛋白质分析检测方法。本论文研究工作从提高检测方法的灵敏度、简化实验操作的角度出发,基于DNA和B淀粉样肽在电极表面的自组装并通过设计电化学信号的放大策略,结合灵敏的电化学技术,实现了靶标蛋白的灵敏分析。具体内容如下:  1、基于DNA自组装的蛋白质定量新方法  在论文本部分研究工作中,基于DNA在电极界面的自组装,通过双重信号放大反应,实现了靶蛋白的超灵敏检测。具体而言,靶蛋白被修饰在电极表面的核酸适体所捕获,并经点击化学效应介导的DNA链取代,靶蛋白被取代下来,这一过程可循环进行,形成第一重信号放大;同时,由于靶蛋白从电极表面被取代下来以后,电极表面的适体暴露出足够多的碱基因而可以与信号DNA(RPDNA)互补配对,进而促发DNA自组装,形成第二重放大,因此,大量的带正电荷的电化学活性物质(六铵合钌)因为可以与带负电荷的双链DNA结合而负载在电极表面,产生显著的电化学信号,从而实现了对靶蛋白的超灵敏检测。以凝血酶的定量分析为例,在100fM到10nM范围可对凝血酶进行检测。同时,由于检测过程中无需蛋白酶的参与,因而整个分析过程简单易行。基于以上优点,本文所提出的蛋白质定量新方法未来在临床诊断和生物医学研究将具有很好的应用前景。  2、基于β淀粉样肽自组装的蛋白质定量新方法  在论文该部分工作中,基于β淀粉样肽在电极界面的自组装,借助β淀粉样肽与其他生物活性物质的相互作用,提出了一种蛋白质定量电化学分析新方法。具体来说,β淀粉样肽自组装而形成的多肽复合物可作为一个多功能传感元件,有效避免了传统方法中传感探针的固定和层层修饰,极大地简化了操作步骤,与此同时,由于β淀粉样肽组装而形成的多肽复合物含有一个催化中心,因此可实现输出信号的放大。以一种前列腺癌标志蛋白,微管蛋白酪氨酸连接酶类似物12(TTLL12),为研究靶标,实现了对该蛋白标志物的超灵敏检测。结果表明,使用本方法,TTLL12的检测范围可达3pM到30nM,不仅预示着本方法今后将可能在生物医学研究及临床诊断应用方面的前景,而且表明,本论文研究工作所提出的多肽自组装可以在生物传感界面的构建中发挥重要作用。
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