KIR、HLA-Cw基因分型分析及HCV体外感染人CD4+T细胞靶细胞模型的建立的研究

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目的:本次研究主要完成了1.对40例健康汉族人群KIR, HLA-Cw位点基因分型,分析并分选出KIR2DL3+/HLA-Cl+个体;2.建立HCV体外感染人CD4+T细胞靶细胞模型。本次研究的两部分内容为KIR2DL3/HLA-C1基因组合与NK细胞体外抑制HCV复制相关性研究的关键前提和基础。方法:第一部分:取随机抽取的40例健康汉族人群外周血样本,采用商用试剂盒严格按照说明书进行KIR、HLA-Cw位点的基因分型;采用直接计数法对分型结果进行综合分析。第二部分:采用脂质体转染法进行HCVRNA对Huh-7.5细胞的转染,RT-PCR检测转染后细胞内HCVRNA复制情况;Western blot检测转染后细胞内HCV NS3.NS5A蛋白的表达情况;免疫荧光法检测转染后细胞内NS5A蛋白的细胞定位。检测成功后,收集产生自上述HCV Huh-7.5细胞体外培养系统的HCV病毒颗粒,与分离自抗HCV阴性个体的CD4+T细胞共同孵育,RT-PCR检测共孵育后CD4+T细胞内HCVRNA复制情况;Western blot检测共孵育后CD4+T细胞内HCV NS3、NS5A蛋白的表达情况。结果:第一部分:40例样本中HLA-Cw位点HLA-C1基因出现频率较HLA-C2高,且HLA-C1C1出现的频率较HLA-C1C2高;KIR基因型中,以3DL1、2DL1、2DL3、2DL4、3DL2、3DL3、2DP1、3DP1、2DS4出现频率较高,而3DS1、2DS1.2DS2、2DS3、2DS5、2DL2、2DL5出现频率较低;KIR2DL3+/HLA-C1C1例数较KIR2DL2+/HLA-C1C1多。以上可见,KIR2DL3+/HLA-Cl+基因型组合以KIR2DL3-2DL3/HLA-C1C1者较多,占总样本数52.5%。第二部分:在HCV Huh-7.5细胞体外培养系统的构建中,RT-PCR检测到转染后Huh-7.5细胞内HCVRNA的复制;Western blot检测转染后Huh-7.5细胞内HCV NS3及NS5A蛋白的表达;免疫荧光法对转染后细胞内HCV NS5A蛋白成功进行了定位。产生自HCV Huh-7.5细胞体外培养系统的HCV病毒颗粒与CD4+T细胞共同孵育,RT-PCR及Western blot技术分别检测到共孵育后CD4+T细胞内HCVRNA的复制及HCV NS3及NS5A蛋白的表达。结论:第一部分:根据KIR.HLA-Cw分型结果进行分析,我们得到KIR2D L3+/HLA-Cl+(KIR2DL3-2DL3/HLA-CICl、KIR2DL3-2DL2/HLA-C1C1).—/HLA-Cl+(KIR2DL2-2DL2/HLA-CICl)、KIR2DL3+/—(KIR2DL3-2DL2/C2-)4种基因组合个体。第二部分:我们成功建立了HCV(J6/JFH)Huh-7.5细胞体外培养系统,并产生具有感染作用的HCV病毒颗粒;利用上述病毒颗粒在体外成功进行了对人CD4+T细胞的感染,建立了HCV体外感染人CD4+T细胞靶细胞模型。
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