【摘 要】
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目的:SHP2作为一种由PTPN11基因编码的非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶,是多种受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinases,RTKs）激活KRAS或BRAF及其下游信号RAS/ERK和PI3K/AKT信号的关键承接点,其抑制剂SHP099在肺癌、胰腺癌及食管癌中发挥重要作用,而在结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）中的作用机制尚未报道。而且,某些研究发现SH
【基金项目】
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国家自然科学基金（81774079）；
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目的:SHP2作为一种由PTPN11基因编码的非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶,是多种受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinases,RTKs）激活KRAS或BRAF及其下游信号RAS/ERK和PI3K/AKT信号的关键承接点,其抑制剂SHP099在肺癌、胰腺癌及食管癌中发挥重要作用,而在结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）中的作用机制尚未报道。而且,某些研究发现SHP099对KRAS或BRAF突变的CRC细胞可能并不敏感。尽管ERK信号在SHP2抑制后的变化已被广泛研究,但SHP2抑制后AKT信号的变化仍不清楚。为解决以上问题,本研究开始探索SHP099与CRC中AKT信号之间的联系,同时评价雷公藤红素（Celastrol,CLS）、FAK抑制剂与m TOR抑制剂对SHP099的增敏作用和机制。方法:1.免疫组织化学:为检测p-SHP2在CRC中的表达水平,采用免疫组织化学方法对CRC标本和非癌标本中的p-SHP2进行检测与定位,从而探讨p-SHP2作为CRC治疗靶点的意义。2.生物信息学分析:从肿瘤蛋白组图谱（TCPA）网站下载肿瘤标本和肿瘤细胞系的p-SHP2表达数据,通过反相蛋白阵列（RPPA）检测,将CRC与其它类型癌症中的p-SHP2表达进行比较,并分析其中位数排序。从以往文献中下载SHP099对肿瘤细胞系的半数抑制浓度（IC50）数据,IC50值超过30μg/m L定义为耐药,然后分析耐药细胞系在癌症类型、突变状态（KRAS和BRAF突变）和p-SHP2表达（高或低）亚群中的分布。3.长期平板克隆形成实验:以CRC细胞为模型,使用不同浓度的SHP099及其他药物进行处理,细胞集落数反映抑制率变化,分别评价FAK抑制剂、m TOR抑制剂和CLS在体外对SHP099的增敏效果。4.动物实验:使用CRC细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型,将裸鼠随机分为空白对照组、SHP099用药组、FAK抑制剂/m TOR抑制剂/CLS用药组及两药联用组,将数据制成瘤体生长曲线和体重波动曲线,分别评价FAK抑制剂、m TOR抑制剂和CLS在动物体内对SHP099的增敏效果。5.蛋白免疫印迹（Western blot）:基于CRC细胞实验样品,使用Western blot方法探索SHP099耐药机制、检测SHP099与FAK抑制剂联用对CRC细胞信号转导和相关蛋白（如ERK、AKT等）表达的影响。结果:1.免疫组化结果提示SHP2主要位于上皮细胞的细胞质中,而且在CRC中SHP2蛋白的水平显著升高。2.通过分析TCGA-RPPA数据中p-SHP2的表达情况,发现CRC中p-SHP2的中位表达水平位于31种癌症类型的前列;但BRAF和KRAS野生型细胞中p-SHP2的状态与SHP099耐药之间仅存在边际显著性（P＞0.05）。3.SHP099与FAK抑制剂/m TOR抑制剂/CLS联用对CRC细胞有协同致死效应,在体外显著抑制CRC细胞的克隆形成。4.通过体内实验,发现SHP099、FAK抑制剂、m TOR抑制剂及CLS都能抑制裸鼠皮下移植瘤的生长,且两药联用组效果明显优于单药组,各组小鼠体重无明显波动。5.Western blot结果表明,SHP099对Caco-2、CW-2、RKO、Colo205、SW480及SW620细胞中的p-AKT仅有短暂抑制作用;SHP099分别处理Colo205细胞和SW620细胞后,直接诱导p-FAK水平显著升高,且伴随着p-AKT的反馈激活,两株细胞的p-FAK基线水平较低;SHP099与FAK抑制剂联用对AKT信号持续抑制。结论:1.磷酸化SHP2在CRC细胞中呈现高表达水平,其在CRC的靶向治疗中具有重要意义,CRC细胞对SHP2抑制剂广泛耐药,其耐药机制不能用RAS/BRAF突变和p-SHP2表达状态充分解释。2.CRC细胞对SHP099耐药,其机制与ATK信号的反馈性激活密切相关;SHP099使用可释放SHP2对p-FAK的抑制,从而通过p-FAK激活途径引起AKT信号激活;高基线水平p-FAK可促进CRC细胞对SHP2抑制剂的抵抗。3.SHP2与FAK抑制剂联用不仅消除了SHP2抑制所导致的FAK激活,而且共同驱动了AKT信号的持续抑制。4.雷公藤红素/FAK抑制剂/m TOR抑制剂对SHP099均有增敏作用,联用能显著抑制CRC细胞体内外的生长。
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