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灵芝(Ganoderma lucidum)为多孔菌科的担子菌,在中国已有2000多年的民间药用史,主要用于治疗肝炎、慢性气管炎、哮喘、心绞痛、高血压、神经衰弱和肿瘤等疾病。近年来,关于灵芝提取物的研究已在全世界范围展开,多糖作为灵芝中主要的有效成分之一,受到了越来越多的关注。研究证明,灵芝多糖具有增强免疫功能、抑制肿瘤、降血糖、延缓衰老等作用。由于目前对灵芝均一多糖组分的详细化学结构报道较少,为系统地研究灵芝多糖的化学结构和生物活性,本文对灵芝子实体多糖组分进行了分离纯化、结构解析及免疫活性研究。
本论文共有三个部分,分别从多糖的脱色工艺、分离纯化和理化性质、结构分析和免疫活性等方面进行了研究。主要结果如下:
1灵芝子实体多糖的分离纯化及理化性质研究119#灵芝子实体经醇脱脂,热水浸提后超滤分级得到四个组分GLPA、GLPB、GLPC和GLPD。
通过单因素试验和正交试验,筛选出适宜GLPA脱色的工作条件为:AB-8树脂、pn=4.0、T=60℃,在此条件下多糖脱色率可达87.38%,多糖保留率为89.24%,蛋白质去除率为77.11%。
利用阴离子柱交换层析(DEAE-SepharoseFF)和凝胶柱层析(SephacrylS300)对GLPB进行了分离纯化,得到两个均一多糖,用高效液相色谱法、苯酚-硫酸法和BCA法对其分子量、总糖含量和蛋白含量进行鉴定,结果如下:
GLPBW1-1和GLPBS1-1-a为白色絮状样品,且均易溶于水、二甲基亚砜,难溶于乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂。
2灵芝子实体多糖结构的初步研究通过红外光谱分析、单糖组成分析、甲基化分析和核磁共振(一维:1HNMR谱、13CNMR谱;二维:1H-1HCOSY谱、TOCSY谱、NOESY谱、HMQC谱和HMBC谱)技术,研究了GLPBS1-1-a的化学结构。
单糖组成分析结果表明GLPBS1-1-a含有岩藻糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖,以1:4.5:1.6:0.9组成。甲基化分析结果表明,岩藻糖以端基方式连接,半乳糖主要以1,6-和1,2,6-两种方式连接,还有一些其它的连接型式单糖残基存在,三个主要残基的摩尔比约为1:4:1。由NMR进一步分析结果表明GLPBS1-1-a存在以下结构重复单元:
3灵芝子实体多糖的体外免疫活性研究GLPA及脱色后的GLPAT对小鼠脾淋巴细胞均无明显刺激增殖作用;GLPB经阴离子柱交换层析分离后,所得各组份GLPBW、GLPBS1和GLPBS2均有较高的刺激小鼠脾淋巴细胞增殖作用,水相组分GLPBW增殖作用高于盐相组分GLPBS1和GLPBS2;GLPBW和GLPBS1经阴离子柱交换层析和凝胶柱层析纯化后,各组分均具有明显的刺激小鼠脾淋巴细胞增殖作用,且部分有剂量依赖性关系;但发现纯化后的组分活性较上一级组分活性低。