肉制品中甲型副伤寒沙门氏菌rpoE基因的应激特性研究

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【目的】甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphoid A,SPA)是一种能够引起急性消化道传染病的革兰氏阴性细菌。RpoE基因编码的σ因子,在革兰氏阴性细菌中普遍存在,是一类重要的调节因子,在细菌响应各种环境胁迫时发挥着重要的调节作用。本研究主要是模拟在肉制品杀菌过程中,以营养丰富且复杂的肉制品为介质,来观察甲型副伤寒沙门氏菌rpoE基因的热应激特征以及肉制品脂肪对菌株的保护是否是通过rpoE的调节作用来完成的研究,从而进一步利用转录组学对菌株受脂肪的影响进行初步探究。【方法】(1)采用Red同源重组方法来构建甲型副伤寒沙门氏菌rpoE缺陷菌株。首先对缺陷株△rpoE和野生株在最适温度的生长情况进行分析,然后以55℃、63℃、72℃对接种108CFU/g甲型副伤寒沙门氏菌缺陷株△rpoE和野生株的介质进行热处理,测定处理后样品中甲型副伤寒沙门氏菌的残存数量,比较缺陷株和野生株在肉制品加工中的失活情况。(2)首先以55℃、63℃、72℃对接种108CFU/g甲型副伤寒沙门氏菌缺陷株△rpoE和野生株的不同介质(50%肥肉灌肠、100%纯瘦灌肠)进行热处理,测定处理后样品中甲型副伤寒沙门氏菌的残存数量,比较缺陷株和野生株在不同脂肪介质下的失活情况,对野生株和缺陷株在不同脂肪介质下的耐热情况进行分析,然后利用Real-time PCR技术检测野生株在近似巴氏杀菌条件55℃、30min下不同脂肪介质中热处理后的残存菌体样本的rpoE基因的表达水平,比较脂肪对rpoE表达水平的影响。(3)以55℃对接种108CFU/g甲型副伤寒沙门氏菌的不同介质(50%肥肉灌肠、100%纯瘦灌肠)进行热处理30min,收集菌体,提取菌株的RNA进行转录组学分析,通过对差异基因结果分析,寻找菌株受脂肪影响的候选基因。【结果】(1)成功构建了甲型副伤寒沙门氏菌rpoE缺陷菌株,为沙门氏菌的敲除技术提供了可靠的数据基础。在适宜温度37℃条件下,缺陷株和野生株的生长情况没有显著性差异(p>0.05)。野生株和缺陷株在55℃的D值分别为14.0980min、10.8933min,在63℃的D值分别为1.3078min、0.3147min,在72℃的D值分别为0.9885min、0.9135min,并且三个温度下甲型副伤寒沙门氏菌缺陷株和野生株的D值之间有显著性差异(p<0.05),因此野生株的耐热能力显著高于缺陷株。(2)相同温度下缺陷株和野生株分别在50%肥肉灌肠、100%纯瘦灌肠介质之间的D值都存在显著性差异(p<0.05),肥瘦介质中菌株更耐热,野生株在50%肥肉和纯瘦肉介质的近似巴氏杀菌条件下(55℃,30min)的表达上调水平分别为3.53、3.29倍,且不同介质下处理rpoE基因上调水平不存在显著性差异(p>0.05)。(3)进一步证实了rpoE基因的表达不受脂肪的影响。55℃,30min热激条件下,相对于介质纯瘦肉灌肠,在介质50%肥肉灌肠中,逆境压力基因(dpS、osmC、psp),胞内信号传导(SPA4365)、细胞分裂负调控基因(sulA)、催化活性调控(wzC)、氧化还原(pspB、ahpC、Novel305)、转录调控(marR)等基因发挥了作用,对胁迫环境进行了适应。【结论】成功构建了甲型副伤寒沙门氏菌rpoE缺陷菌株,在肉制品杀菌过程中,甲型副伤寒沙门氏菌在应对热应激条件时,rpoE基因表达上调,对菌株的生存发挥了重要作用;肉制品脂肪对菌株有保护作用,但并不会通过调节rpoE基因来保护。55℃,30min热激条件下,相对于介质纯瘦肉灌肠,在介质50%肥肉灌肠中,一系列候选基因,逆境压力基因(dpS、osmC、psp),胞内信号传导(SPA4365)、细胞分裂负调控基因(sulA)、催化活性调控(wzC)、氧化还原(pspB、ahpC、Novel305)、转录调控(marR),对胁迫环境进行了适应,为探究甲型副伤寒沙门氏菌在不同介质中基因的表达提供了依据。
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