实验目的和背景:股骨头缺血性坏死的治疗是骨科临床难题之一,目前尚未发现一种可逆转和终止已发生股骨头坏死病理过程,从而阻止股骨头进一步塌陷的有效方法。在股骨头坏死区的修复与重建过程中,坏死骨的吸收是塌陷的主要原因,减少或终止坏死骨的吸收可延迟或避免坏死股骨头塌陷的发生,一些研究结果证明快速血管化和加速成骨可减少骨吸收的发生,其原理可能是血液循环的改善对OCN、BMP、TNF、TGF 等细胞因子局部含量,进一步影响破骨细胞的活性。因此,为达到这个目标需要解决以下几个问题:1.快速重建股骨头坏死部分的血液循环;2.促进新骨形成,重建后的骨小梁的质量和数量能满足软骨下骨支撑的需要。良好的血运是坏死区愈合的基础。VEGF 是目前所知唯一特异作用于血管内皮细胞的细胞因子,可以刺激前体血管内皮细胞和骨细胞分化增殖,具有改善局部血运、加快骨的形成和重新塑形的功能。提示VEGF 可能在坏死股骨头愈合过程中具有重要意义。本实验从这个目的出发,以液氮冷冻兔股骨头坏死模型为研究对象,共使用日本大耳白兔165 只制作股骨头坏死动物模型,首先利用基因重组技术构建重组腺病毒AD-huVEGF121,建立液氮冷冻兔股骨头坏死模型,AD-huVEGF121转染坏死股骨头,利用RT-PCR、免疫组化、组织形态学观察、血管定量分析、骨折端血流量测定、X 线照相、骨密度测定等技术手段观察其促进坏死股骨头血管重建和骨修复的作用。实验内容主要分三部分进行:1 重组腺病毒AD-huVEGF121的构建;2.股骨头坏死模型的建立;3. AD-huVEGF121转染坏死股骨头,观察其局部的表达、促进坏死区血管重建、促进坏死股骨头修复的作用。实验方法和结果: 第一部分:模型构建利用液氮冷冻法造成股骨头无菌性坏死,术后8 周和12 周X线检查见股骨头出现小的硬化区,密度不均匀。同时组织学观察到靠近股骨颈的坏死骨小梁表面有新骨形成、软骨下骨以骨吸收为主,骨吸收发生在无新骨形成的裸露的坏死骨小梁表面。BMD结果术后8 周和12 周手术侧股骨头BMD 显著高于正常侧对照。第二部分:携带huVEGF121基因的重组腺病毒载体构建与表达鉴定1. 用酶切法和测序法鉴定了pUC18-huVEGF121,保证了外源基因序列的正确性。