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乳房炎是奶牛最常见和最复杂的疾病之一,给世界奶牛业造成了巨大的经济损失。除改善母牛营养、加强环境卫生管理和改进挤奶技术外,研究者正试图通过遗传育种和兽医生物技术手段来预防和控制乳房炎。本研究对扬州周边4个牧场奶样中的主要病原菌(大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌)进行了分离鉴定；运用荧光定量PCR技术检测了IL8、CXCR1、TLR4、LYZ和LF5个相关基因在主要病原菌攻毒下在奶牛乳腺细胞中的表达规律；同时以来自30个公牛家系的610头中国荷斯坦牛为研究对象,通过PCR-SSCP、PCR-RFLP和测序相结合的方法,对以上5个基因进行了单核苷酸多态性(SNPs)扫描并分析其与泌乳性状和体细胞评分(SCS)的关系；采用Logistic回归模型和多因子降维法(multifactor dimensionality reduction,MDR)法对IL8和CXCR1基因的5个SNPs进行聚合效应分析；最后通过荧光定量PCR技术对奶牛血液中IL8和CXCR1基因mRNA的含量进行了分析。主要研究结果如下：1.采用BMT法整群抽样检测了4个奶牛场310头无临床症状的荷斯坦奶牛隐性乳房炎,其中有139头患有隐性乳房炎,发生率44.84%,在1163个乳区中,患病乳区有208个,乳区患病率为17.88%。在208份奶样中共分离到葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌3种主要病原菌322株,其中葡萄球菌71株,占分离菌株的22.05%：大肠杆菌95株,占分离株数的29.50%；链球菌156株,占分离菌株的48.45%；分析感染情况表明,病原菌单独感染率为43.16%,其中链球菌的单独感染率达31.65%；病原菌混合感染率占54.68%,主要为大肠杆菌和链球菌混合感染。2.对奶牛的乳腺细胞进行培养,采用大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌对乳腺细胞进行了攻毒实验,检测奶牛乳房炎抗性候选基因(IL8、CXCR1、TLR4、LYZ和LF基因)在不同菌种刺激下在乳腺细胞的表达规律。结果发现在刺激后的不同阶段均检测到5个基因的mRNA,在不同的阶段表达量不同,说明在主要病原菌刺激下,5个基因的均显示出抗菌反应。IL8基因和CXCR1基因在葡萄球菌的刺激下随着时间的延长表达量逐渐提高；TLR4基因在大肠杆菌的刺激下表达量显著高于其它两种菌种；LF基因在三种菌种刺激下,随着时间的延长,表达量逐渐提高；LYZ基因在三种菌的刺激下,表达量较低,但随着时间的延长都有提高的趋势。3.对IL8、CXCR1、TLR4、LYZ和LF基因的多态性检测发现11SNPs位点(IL8-233(G>A)、IL82789(A>G)&2862(T>C)、CXCR1-1830(A>G)、CXCR1-1768(T>A)、CXCR1-344(T>C)、CXCR1783(C>A)、LYZ115(T>G)、TLR4-226(G>C)、 TLR4exon31760(C>T)、LF exonl133(G>C)和LF-3727(C>G)&-3717(A>G)),将突变位点基因型与泌乳性状以及体细胞评分进行了关联分析,主要结果如下：IL8-233(G>A)位点对体细胞评分达到极显著水平(P<0.01),GG基因型体细胞评分极显著小于GA和AA基因型(P<0.01); IL82789(A>G)&2862(T>C)位点对体细胞评分、测定日产奶量和305d校正产奶量的影响达到极显著水平(P<0.01),结果显示：KK基因型测定日产奶量、305d校正产奶量极显著高于AA和KA基因型型(P<0.01)。KK基因型的体细胞评分(SCS)极显著低于KA、AA基因型(P<0.01)。对于测定的乳蛋白率AA基因型显著低于KA、KK型(P<0.05)：CXCR1-1830(A>G)位点对体细胞评分、测定日产奶量、测定日乳脂率和305d校正产奶量的影响达到极显著水平(P<0.01),结果显示：在-1830(A>G)位点AA基因型个体的体细胞评分最小二乘均值与AG基因型相比达到极显著水平(P<0.01)；AG基因型的测定日产奶量显著高于AA和GG基因型(P<0.01)；AA基因型的测定日乳脂率显著高于AG基因型(P<0.01)；AG基因型的305天校正产奶量极显著高于AA基因型(P<0.01),显著高于GG基因型(P<0.05)；CXCR1-1768(T>A)位点对体细胞评分、测定日产奶量和305d校正产奶量的影响达到极显著水平(P<0.01),结果显示：TT基因型个体的体细胞评分最小二乘均值显著小于TA基因型(P<0.01)；TA基因型的测定日产奶量显著高于TT和AA基因型(P<0.01)；TA基因型的305d校正产奶量极显著高于AA和TT基因型(P<0.01); CXCR1-344(T>C)位点对体细胞评分、测定日产奶量和测定日蛋白率的影响达到极显著水(P<0.01),结果显示：TT基因型个体的体细胞评分最小二乘均值显著小于TC和CC基因型(P<0.01)；TT基因型的测定日产奶量极显著高于CC基因型(P<0.01)；显著高于TC基因型(P<0.05)。CC基因型的测定日蛋白率极显著小于TT和TC基因型(P<0.01)；TLR4-226(G>C)位点对305d校正产奶量影响达到极显著水平(P<0.01),对测定日产奶量到显著水平(P<0.05),结果显示：CC基因型305d校正产奶量显著高于GC和GG基因型(P<0.01),CC基因型的测定日产奶量显著高于GC和GG基因型(P<0.05)；TLR4基因exon31760(C>T)位点对体细胞评分、测定日产奶量和测定乳蛋白率影响达到极显著水平(P<0.01),测定乳脂率达到显著水平(P<0.05),结果显示：CC基因型的体细胞评分显著低于CT和TT基因型；CT基因型的测定日产奶量极显著高于TT,显著高于CC; TT基因型测定日乳蛋白率极显著高于TC, CC显著高于TC；TT基因型的测定日乳脂率极显著高于TC和CC基因型,CC基因型显著高于TC基因型；LYZ115(T>G)位点对SCS、乳脂率和305d产奶量有极显著影响(P<0.01),对乳蛋白率有显著影响(P<0.05),GG基因型个体的SCS极显著低于TT基因型(P<0.01),显著低于TG基因型(P<0.05)；GG基因型的305d产奶量极显著高于TT基因(P<0.01),显著高于TG基因型,乳脂率和乳蛋白率基因型之间差异不显著；LF-3727(C>G)&-3717(A>G)位点对体细胞评分影响达到极显著水平(P<0.01),对测定日产奶量的影响达到显著水平(P<0.05),结果显示：TT基因型体细胞评分极显著低于AA和TA基因型(P<0.01)。TT和TA基因型的测定日产奶量显著高于AA基因型(P<0.01)。LF基因exon1133(G>C)突变位点对测定日产奶量、测定日乳脂率、测定日乳蛋白率和305d校正产奶量影响达到极显著水平(P<0.01),对体细胞评分影响显著(P<0.05)。结果显示：GG基因型的测定日产奶量极显著高于CC(P<0.01),GC基因型的体细胞评分显著高于GG和CC基因型(P<0.05)。4.MDR法、MPVA法和Logistic回归分析CXCR1和IL8基因各位点突变及其基因型组合对奶牛乳房炎易感性的影响,单因素Logistic回归分析结果表明：CXCR1基因和IL8基因五个SNP位点变异对该牛场奶牛乳房炎易感性均没有达到显著水平,但MDR分析发现CXCR1(-1768)-IL8两位点、CXCR1(-1768)-(783)-IL8三位点及CXCR1(-1768)-(-344)-(783)-IL8四位点交互作用均达到显著水平,且交叉验证一致性均为最大(10/10)。CXCR1(-1768)-(783)-IL8三位点互作模型和CXCR1(-1768)-IL8二位点互作模型检验样本准确度较高(分别为0.5457和0.5485),但四个位点联合效应分级图表明CXCR1(-1768)-IL8两易感基因型为强正交互作用,同时将CXCR1(-1768)-(783)-IL8三位点互作效应和CXCR1(-1768)-IL8二位点互作效应；MPVA法得出CXCR1(-1830)-(-1768)-IL8为最佳组合。综合分析得出：CXCR1(-1768)-IL8二位点互作效应对该牛场奶牛乳房炎易感性达到显著水平。5.通过荧光定量PCR技术检测CXCR1-1768(T>A)、IL8-233(G>A)和IL82789(A>G)&2862(T>C)的突变位点不同基因型在奶牛血液中的表达变化。结果表明,对于CXCR1-1768(T>A)位点产生的三种基因型,TT和TA基因型的表达量显著高于AA基因型,TT的表达量最高；对于IL8-233(G>A)位点产生的基因型,GG基因型的表达量极显著高于AA和AG两种基因型(P<0.01)；对于IL82789(A>G)&2862(T>C)位点,KK基因型的相对表达量极显著高于KA基因型(P<0.01),显著高于AA基因型(P<0.05)。