研究背景和目的肿瘤异质性一直是肿瘤治疗中存在的重要挑战,同一肿瘤中可以存在许多不同基因型或亚型的细胞,在肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭转移以及对治疗的敏感性等方面产生差异。关于肿瘤异质性产生的机制,得到多数人认可的主要是克隆进化学说和肿瘤干细胞学说。越来越多的证据表明,只有一小部分细胞负责肿瘤的发生、侵袭转移和对化疗耐药,这部分细胞被称为肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)。肿瘤干细胞具有无限自我更新并分化成多种类型细胞的能力。因此,区别和分离肿瘤干细胞在肿瘤治疗中显得尤为重要。为了研究具有不同增殖和分化能力的肿瘤干细胞,我们首先要优化检测细胞增殖的方法。测定体内外细胞增殖的方法有很多,但这些方法无疑只能检测较窄时间窗内体外培养细胞的分裂,或追踪最近分裂的细胞,且无法对活细胞做进一步的分子生物学分析,更不能定量检测不同细胞亚群的增殖情况。传统的常用检测细胞增殖的方法包括5-溴-2脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)染色、溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)试验、荧光染料标记测定(CFSE、PKH)等。BrdU是一种嘧啶核苷酸类似物,其检测原理是BrdU能在细胞周期的S期渗透进DNA中,再利用BrdU抗体与DNA中的BrdU特异性结合,即可检测到DNA复制活跃的细胞,这是通过直接测定细胞中的DNA来检测细胞增殖,是最准确的方法,但这种测定方法需要细胞样品经历酸解、热解、酶解等使DNA变性的过程,细胞的结构和活性遭到严重的破坏,以致难以进行后续的实验。此外,即便是高浓度的BrdU也只能追踪检测三个细胞周期内的分裂情况。另有研究表明经BrdU标记后,细胞生长停滞在G2期,且经NP4处理后的细胞不能恢复细胞活性。有报道指出,在体外培养的神经前体细胞及干细胞中,低剂量、单脉冲的BrdU亦表现出明显的抗增殖作用以及对细胞特性和细胞活性的影响。另外一个检测体外细胞增殖的方法是MTT试验。MTT法是通过细胞代谢来检测细胞增殖。MTT是一种黄色染料,活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶能够将穿透进细胞膜中的MTT还原成不溶于水的蓝紫色甲躜结晶,蓝紫色结晶经DMSO溶解后,在酶标仪上测定OD490nm处的吸光度值,结晶的吸光度值与活细胞数量成正比。MTT试验己广泛用在检测药物对细胞的毒性和生长抑制性,然而这个方法测定的只是活细胞的相对数量而不是绝对数量,而且同样的,细胞经MTT代谢后无法保存活性。荧光染料5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)目前已广泛应用于示踪体内外细胞的分裂、转移和定位。CFSE可与胞内蛋白不可逆结合,并随着每一次细胞分裂CFSE标记的荧光平均分配到两个子代细胞中。CFSE标记的细胞在荧光衰减至接近自发荧光前可被检测到多达8次的细胞分裂,在体内标记中,也可观察长达数周时间。然后,CFSE标记的其中一个弊端是,CFSE在一定程度上有细胞毒性且抑制细胞增殖,虽然降低CFSE浓度能尽量避免其细胞毒性,然而却会减少其可检测的细胞分裂次数。在一些研究中,PKH26荧光染料标记被用来分离恶性胶质瘤、乳腺癌和卵巢癌中的静止细胞,他们用PKH26高表达、低表达和不表达来描述分选出的细胞的不同特性,然而这个描述是主观界定的。PKH26的标记过程中需要添加多种反应试剂及经历多次洗涤,相当复杂和费时。虽然PKH26可以示踪体内和体外细胞的增殖,但在冰冻切片和特殊爬片技术中的使用却受到限制。在本研究中,我们描述了一种利用细胞膜荧光染料DiO/DiD来示踪肿瘤细胞并定量检测体内外肿瘤细胞分裂次数的新方法。DiO/DiD属于长链羰花青荧光染料,是一种亲脂性膜染料,它在水溶液中荧光极弱,然而当用稀释的染液标记细胞时,DiO/DiD中的烷基链嵌入细胞膜的磷脂双份子层中,并激发出强烈的绿色／红色荧光。用于示踪细胞增殖时,随着细胞的每一次分裂,膜染料DiO/DiD的荧光能准确地平分到两个子代细胞上。DiO/DiD染料具有低荧光变异性、良好的标记稳定性、低细胞毒性以及极少发生细胞间转移这些优点,此外,DiO/DiD并不影响标记细胞及后代细胞的增殖,并能通过建立细胞分裂标准曲线定量检测体内外细胞分裂情况。鉴于DiO/DiD染料的这些特性,本课题组探究了DiO/DiD标记体内外培养细胞的可行性,检测了DiO/DiD标记细胞的分群情况,并结合CD133抗原分子的表达分析肿瘤细胞耐药性。利用本文中建立的DiO/DiD标记肿瘤细胞定量检测细胞增殖的方法,我们还探究了肝脂肪酶(hepatic lipase)及CD133在HepG2肝癌细胞化疗耐药中的作用。在本课题组的前期研究中,针对肝脂肪酶(LIPC)基因构建EGFP-shRNA干扰慢病毒载体,转染HepG2细胞并筛选稳定表达株,发现下调LIPC后HepG2细胞增殖显著减慢,克隆形成显著减少,且CD133阳性细胞百分比亦显著下降,对阿霉素、5-fu化疗产生抵抗。本研究利用DiO/DiD标记细胞的方法进一步探讨LIPC、CD 133与肿瘤细胞增殖和化疗的关系。研究方法1.细胞膜荧光染料DiO/DiD的研究,包括其细胞毒性及标记稳定性。1.1 MTT法检测细胞膜荧光染料染色后细胞的增殖。分别检测Lovo细胞、SW480细胞、SW620细胞、CT26细胞以及HepG2细胞的增殖情况。1.2流式细胞术检测DiO/DiD标记的稳定性。1.2.1体外培养：将DiO标记的人HepG2细胞与未标记的小鼠CT26细胞以1：1的比例共培养1周,然后用Percp-EPCAM抗人抗体染色后,上流式细胞仪检测。该方法原理：EPCAM抗体为抗人抗体,因此HepG2细胞高表达EPCAM,而CT26为小鼠细胞,不表达EPCAM,因此利用EPCAM和DiO/DiD双染色可以检测细胞膜染料在细胞之间是否发生转移。1.2.2体内培养：收集DiD标记的HepG2单细胞悬液并注射到BALB/c小鼠肝被膜下,并以未标记DiD的HepG2细胞作为阴性对照,8天后分离肝内肿瘤并制得单细胞悬液,染Percp-EPCAM抗人抗体后流式检测。2.建立定量检测体内外肿瘤细胞增殖的标准曲线。2.1方法原理：研究表明DiO染料的荧光强度在一定时间内(≤15天)并没有发生衰减,DiO标记细胞后随着细胞的每一次分裂,荧光平均分配到两个子代细胞中,因此我们可以推断出：当M为细胞平均荧光强度,N为细胞数目,S为细胞分裂次数,可有以下公式成立：M初*N初=M末*N末,log2M初/M未=S=1og2N末/N初,即S=log2M初-log2M末。由于M初为一可检测固定值,因此可应用R软件对S和M末进行对数曲线拟合,建立细胞分裂标准曲线。2.2不同血清浓度培养下细胞增殖分裂标准曲线。将DiO标记的细胞后以合适密度铺于六孔板中,用含不同血清浓度(10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%)的培养基培养至80%～90%汇合度后,收集细胞并进行细胞计数,流式检测每孔细胞的平均荧光强度。应用R软件、Excel建立细胞平均荧光强度值与细胞分裂次数之间的对数拟合公式和拟合曲线。根据标准分裂曲线公式,可通过检测DiO标记后的荧光强度计算活细胞亚群的分裂次数。2.3不同培养时间细胞增殖分裂标准曲线。DiO标记的CT26细胞和HepG2细胞以适当密度N1培养于六孔板中,当细胞汇合度达80～90%时,收集细胞,取1/5细胞继续培养,剩余4/5细胞进行细胞计数记为N,并测定其平均荧光强度值M末。重复以上步骤直到细胞平均荧光强度衰减至与DiO自发荧光接近。假设细胞标记培养后不进行收集检测,则每个时间点收集的细胞总数目N。可由以下公式计算得到：Nn= (5N/4)×5n-1(n为细胞的收集次数)。细胞分裂次数S=log2M初/M末=log2Nn/N1,应用R软件、Excel建立细胞平均荧光强度值与细胞分裂次数之间的对数拟合公式和拟合曲线。3.DiO标记方法的体内外应用研究。3.1 DiO标记肿瘤细胞在化疗后的作用。DiO标记的HepG2细胞分别用不同浓度的阿霉素(0.1μM、0.3μM)化疗10天后行流式检测,发现化疗后的HepG2细胞根据DiO荧光强度强弱分为两细胞亚群,分别是DiO-Low和DiO-High细胞亚群。对细胞进行干细胞标志物CD133表达分析,探究CD133与肿瘤化疗的关系。3.2 DiO标记用于肿瘤细胞亚群分选。用流式细胞分选技术对DiO-Low和DiO-High两个细胞亚群进行分选,分选后的细胞继续培养于细胞培养瓶中,3天后分别提取核糖体-新生肽链复合物中的mRNA (RNC-mRNA)。RNC-mRNA被认为与蛋白质丰度有更好的相关性,因此我们认为提取RNC-mRNA进行基因芯片分析有更可信的价值。用100μg/mL环己酰亚胺预处理细胞15min,37℃孵育,然后转移至冰上,用预冷的PBS冲洗两遍,完全吸净PBS溶液,加入1ml细胞裂解液,冰浴30min,刮取裂解细胞产物,转移至预冷的1.5mlEP管中。16000*g, 10min,4℃离心,除去细胞碎片,将裂解产物转移至蔗糖溶液中。在超离心管(9ml)中加入8ml预冷30%蔗糖溶液(用RB buffer溶解),吸取1ml离心上清液缓慢沿管壁加到蔗糖溶液表面,安装预冷的离心管和转子适配器,超速离心(Beckman Coulter L-80XP),330000*g,3h,4℃。整个过程确保在4℃进行以避免RNC-mRNA的降解。离心后,可看到管底透明胶状物,小心把上清吸掉,用100-200ml Rb buffer充分重悬分离产物,加入1ml Trizol,轻轻吹打混匀。然后常规提取RNA,并RNA电泳和分光光度计上检测RNA浓度。3.3 cDNA表达谱芯片分析。所使用芯片为RiboArrayTMgenDETECTTMHuman Array 1×40k(广州锐博生物公司),重复探针3个。分别提取DiO-Low和DiO-High细胞的RNC-mRNA,并常规提取RNA,重复三次,将所得总RNA混匀,用Narodrop、琼脂糖凝胶电泳和Agilent 2200 Bioanalyzer进行RNA质检。取250ng的总RNA合成cDNA并进行CyDye-ULS标记,按照芯片说明书的方法进行芯片杂交,用GenePix 4000B扫描芯片及提取原始数据,进行生物信息学分析。3.4分析早期凋亡细胞和活细胞中DiO荧光强度与细胞分裂次数之间的关系。用20μM阿霉素诱导HepG2细胞凋亡后,收集细胞,台盼蓝染色后细胞计数,然后用Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况,并分析早期凋亡细胞和活细胞的DiO荧光强度和细胞分裂次数之间的关系。3.5 DiO标记肿瘤细胞的体内生长及定量分析。3.5.1 DiO标记的CT26细胞注射到BALB/c裸鼠皮下,分别在第3天、第9天、第14天分离皮下瘤制得单细胞悬液,流式检测细胞平均DiO荧光强度。根据CT26细胞分裂标准曲线,可计算细胞分裂次数。3.5.2 DiO标记的CT26细胞分别注射到BALB/c裸鼠皮下、脾被膜下,并于3天后分离皮下原位瘤、脾脏原位瘤、肝脏转移瘤,制得单细胞悬液,流式测定细胞平均DiO荧光强度。根据CT26细胞分裂标准曲线,可计算细胞分裂次数。比较肿瘤细胞在皮下、脾脏、肝脏的增殖速度。3.5.3 DiO标记的CT26细胞注射到BALB/c裸鼠的肝被膜下,分别在第3、4、5、9、10天分裂肝脏原位瘤以及其他肝叶的转移瘤,制得单细胞悬液,流式测定细胞平均DiO荧光强度。根据CT26细胞分裂标准曲线,可计算细胞分裂次数。比较肿瘤细胞在同一个器官中的原位瘤及转移瘤的增殖速度。4.DiD标记用于检测肝脂肪酶在HepG2肿瘤细胞耐药中的作用。4.]用携带EGFP报告基因的LIPC shRNA干扰慢病毒转染HepG2细胞株,不做稳定细胞株的筛选,常规培养。(未经筛选的HepG2-shLIPC细胞中有敲低LIPC的EGFP阳性细胞及未敲低LIPC的EGFP阴性细胞)4.2取对数生长期细胞,用DID进行膜染色标记后,分别用0.03及0.3μM阿霉素化疗10天,流式检测HepG2-shLIPC细胞的增殖情况。5.分析与统计方法采用SPSS20.0软件进行统计分析。各组数据均由三次独立重复实验所得,以x±s表示。DiO-Low和DiO-High组间比较采用t检验。比较不同浓度化疗药物作用下细胞的增殖采用双因素方差分析,多组间比较采用SNK法。基因芯片数据标准化后筛选差异表达基因,以DiO-High/DiO-Low>2作为上调基因,DiO-High/DiO-Low<2作为下调基因。利用DIVID工具对差异表达基因进行基因功能分类分析(gene ontology analysis, GO)及KEGG pathway注释分析。P<0.05被认为有统计学差异。结果1.细胞膜荧光染料DiO/DiD对细胞增殖的影响。细胞膜荧光染料DiO/DiD不影响细胞增殖。MTT试验结果显示染料标记细胞在第1、2、3天的增殖与未染色细胞的增殖情况无显著差异(P>0.05),说明DiO/DiD染料对细胞增殖无影响。2.细胞膜荧光染料DiO/DiD标记细胞后在体内外培养状况。DiO阳性的HepG2细胞和DiO阴性的CT26细胞共培养一周后染Percp-EPCAM抗人抗体,流式检测结果显示,在EPCAM阴性细胞中DiO阳性细胞所占比例很低(8%±0.096%),即在体外细胞培养中,DiO标记能保持较好稳定性,在细胞间较少发生转移。DiD阳性的HepG2细胞注射至小鼠肝被膜下生长8天后取原位瘤并制得单细胞悬液,染EPCAM抗人抗体后流式检测,结果提示,在EPCAM阴性细胞中DiD阳性细胞所占比例很低(4.5%±0.08%),即在体内细胞培养中,细胞膜荧光染料DiD亦能保持良好稳定性。3.建立DiO定量检测体内外细胞增殖的标准曲线。3.1不同血清浓度培养下细胞的分裂标准曲线。对细胞分裂次数及平均DiO荧光强度值进行对数曲线拟合和建立拟合公式,结果分别是：Lovo:S=-1.79308log2M +16.41884, R2=0.7871; SW480:S=-2.6156 log2M末+16.37847,R2=0.9033；HCT116:S=-2.77449log2M末+29.27126, R2=0.8867; HepG2:S=-1.4299log2M末 +18.82296, R2=0.9044; SW620:S=-1.71533log2M末+1 3.34059,R2=0.9853。3.2不同培养时间细胞的增殖分裂标准曲线。在时间窗内,分别建立CT26细胞和HepG2细胞的分裂标准曲线,分别得到：CT26:S=-1.28089log2M未+14.00148,R2=0.9941; HepG2:S=-1.0812 Iog2M末+11.56886,R2=0.9963。结果显示,在一定时间内,DiO荧光强度的衰减并不影响定量检测细胞分裂次数。4.DiO标记的肿瘤细胞在化疗后的作用。DiO标记的HepG2细胞在阿霉素化疗后,明显地分为两个细胞亚群,我们根据DiO荧光强度的强弱分为DiO-Low和DiO-High亚群,染CD133抗体后发现,DiO-High细胞亚群中CD133的表达较DiO-Low亚群显著增高(P<0.05)对化疗更耐药。5.DiO标记在肿瘤细胞比较早期凋亡和活细胞的影响。DiO标记的HepG2细胞在0.3μM阿霉素作用下培养1周,建立细胞分裂标准曲线为：S=-1.59485 log2M+17.407, R2=0.9202。用20gM阿霉素诱导HepG2凋亡并用试剂盒检测细胞凋亡,结果显示早期凋亡细胞的平均DiO荧光强度比活细胞的平均DiO荧光强度低,根据HepG2细胞在0.3gM阿霉素作用下的分裂标准曲线S=-1.59485 log2M+17.407, R2=0.9202,计算出早期凋亡细胞和活细胞的平均分裂次数分别为3.13和2.96(P=0.035),说明分裂快的细胞更容易发生凋亡,即对化疗药物更加敏感。6. DiO-High/low标记的细胞分选及定量分析。将化疗后明显分群的两个细胞亚群分别标记为DiO-Low组和DiO-High组,用流式细胞分选仪对这两群细胞进行分选,并分别检测分选后两组细胞的DiO平均荧光强度。根据HepG2细胞在0.3μM阿霉素作用下的分裂标准曲线S=-1.59485 log2M+17.407, R2=0.9202计算出两组细胞的分裂次数为：DiO-Low组细胞平均分裂次数为9.6次,而DiO-High组细胞平均分裂次数为2.9次,两者具有统计学差异(P<0.05)。7. DiO-High/low标记的cDNA表达组芯片分析。cDNA表达谱芯片结果显示,在DiO-Low和DiO-High两个细胞亚群中,共发现6521个差异表达基因(筛选标准为差异倍数≥2倍),其中2768个基因发生上调,3753个基因发生下调。对差异表达基因进行基因功能分类分析(gene ontology analysis, GO)分析,结果显示差异表达基因主要参与细胞过程的调节、细胞对刺激的反应、生物调节等生物学过程。KEGG通路分析发现,其富集的生物信号学通路包括：代谢途径、MAPK信号通路、cAMP信号通路、PI3K-Akt信号通路、AMPK信号通路、肿瘤信号通路等。此外,DiO-Low和DiO-High两个细胞亚群在细胞周期、细胞凋亡和多能性干细胞信号通路上的基因表达有显著差异(P<0.001),我们发现在DiO-High组中,一些重要的促凋亡基因,如BIM, BID, BAD, FAS, PRKACB, CASP7, CASP8, CASP10, CASP12表达下调,而一些重要的抗凋亡基因,如DFFA, RELA, NTRK1, CFLAR则表达上调,说明分裂慢的细胞对化疗更耐药,分裂快的细胞对化疗更敏感。同时,与促进细胞增殖相关的基因,包括PCNA、CDK4、cyclin D2、cyclin E1、cyclin A1、 cyclin B3在DiO-Low组(即分裂较快的细胞)中表达上调。在多能性干细胞信号通路中,一些干细胞相关基因,如ABCC8、NANOS1、TCF7、FZD10等在DiO-High亚群中表达明显上调,进一步证明了细胞膜染料DiO标记法可用于定量检测肿瘤细胞增殖、分离细胞亚群及后续的分子生物学研究。8.DiO标记肿瘤细胞的体内生长及定量分析。8.1 CT26细胞在BALB/c裸鼠皮下成瘤,根据CT26细胞分裂标准曲线S=-1.28089log2M末+14.00148,计算得出在第3、9、14天的分裂次数分别为1.2±0.072,2.59±0.078,5.80±0.17。8.2在BALB/c裸鼠皮下、脾被膜下种植CT26细胞,3天后分离原位瘤和转移瘤并检测DiO荧光强度,根据CT26细胞分裂标准曲线S=-1.28089log2M±14.00148,计算得出皮下原位瘤、脾脏原位瘤、肝脏转移瘤的分裂次数分别为1.2±0.072,5.88±0.20,7.784±0.30,在脾脏中,CT26细胞的分裂速度约是皮下的5倍,说明CT26细胞在不同组织中的分裂速度不同。转移瘤的DiO荧光强度显著低于脾脏,我们推断转移瘤中细胞分裂速度更快。8.3在BALB/c裸鼠肝被膜下种植CT26细胞,在第3、4、5、9、10天分裂肝脏原位瘤以及其他肝叶的转移瘤,根据根据CT26细胞分裂标准曲线S=-1.28089log2M末+14.00148,计算得出细胞分裂次数：第3天的分裂次数分别为2.14±0.30、3.61±0.73,第4天为2.67±0.44、3.99±0.22,第5天为5.69±0.44、7.86±0.33,第9天为6.92±0.26、7.63±0.07,第10天为6.86±0.96、9.15±O.40。结果提示在同一器官中,转移肿瘤的平均荧光强度显著低于原位肿瘤的荧光强度,进一步证实无论是在同一个器官中还是在不同器官中,转移瘤中细胞增殖更快。9.DiD标记用于探究肝脂肪酶在HepG2中瘤细胞耐药中的作用。DiD标记的未经阳性筛选的转染了LV-LIPC-shRNA-EGFP的HepG2细胞,用不同浓度阿霉素化疗10天后,发现EGFP+细胞增殖明显减慢,而EGFP-细胞明显分为两群,根据DiD荧光强度不同分为增殖快的细胞和增殖慢的细胞,说明下调LIPC后,HepG2细胞增殖减慢,对化疗产生抵抗。结合本课题组前期发现,下调LIPC后HepG2细胞增殖显著减慢,克隆形成显著减少,且CD133阳性细胞百分比亦显著下降,对阿霉素、5-fu化疗产生抵抗。结论1.细胞膜荧光染料DiO/DiD标记肿瘤细胞后不影响细胞增殖,且在体内外培养中极少发生细胞间转移。2.通过建立DiO平均荧光强度和细胞分裂次数之间的标准曲线,可定量检测肿瘤细胞的分裂增殖,且在时间窗内,荧光强度的衰减不影响其定量分析。3.通过定量分析裸鼠种植瘤中肿瘤细胞的分裂次数,发现转移瘤中细胞分裂速度更快。4.肿瘤细胞化疗后根据DiO荧光强度强弱明显分为两个细胞亚群,且DiO-How细胞亚群的CD133表达增高,对化疗更耐药。5.凋亡实验进一步验证DiO荧光强度低的细胞(即分裂快的细胞)更容易发生凋亡,对化疗更敏感。6.基因芯片结果证实,在DiO荧光强度高的细胞(即分裂慢的细胞)中,促进凋亡和增殖的相关基因表达下调,抗凋亡基因和干细胞相关基因表达上调。7.下调LIPC表达后,抑制HepG2细胞增殖和克隆形成,CD133表达下降,对阿霉素、5-FU化疗耐药。