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山药(Dioscorea opposita)为薯蓣科薯蓣属植物,是世界上重要的药源植物和蔬菜作物。我国是山药的主要发源地,在长期自然进化和人工栽培过程中,形成了很多具有重要价值的类型或品种,保存这些山药类型或品种对我国乃至世界山药产业的可持续发展具有重要的战略意义。传统的山药种质资源保存方法是田间种植保存,需要占用大量耕地、耗费大量的人力,同时由于病虫害、自然灾害等因为,使我国山药种质资源的保存受到严重威胁,一些珍贵的山药种质资源濒临灭绝或已经流失。针对山药种质资源所面临的问题,我们开展了山药种质资源离体保存及DNA指纹图谱构建的研究。主要研究结果如下:
1、建立了山药离体繁殖体系。试管苗可通过丛生芽、带芽节段和微型块茎3条途径进行繁殖,其中带芽节段途径最有利于山药试管苗的繁殖,在含有KT2.0mg·L-1+NAA0.02 mg·L-1-0.2 mg·L-1+3％S的MS培养基上培养,繁殖系数高,速度快。采用该培养基对不同基因型山药的试管苗继代培养达5年,试管苗生长正常。形成的试管苗在KT2.0 mg·L-1+NAA0.02 mg·L-1+PP3330.5 mg·L-1-1 mg·L-1+3％S的MS培养基上生根早,生根率高,根系发达。
2、建立了山药微型块茎诱导形成的“两步液体培养法”模式。即将带芽节段在液体繁殖培养基中培养30 d后再转入诱导培养基中培养60 d形成微型块茎。通过对微型块茎诱导形成的影响因素研究,结果显示蔗糖浓度、植物生长物质组合和光周期对其均有显著影响,以MS+KT0.5 mg·L-1+2,4-D0.1 mg·L-1+PP3330.1mg·L-1+6％S的组合、或转入诱导培养基先暗处理2 d再光照14 h-d-1获得的微型块茎数量最多。
3、建立了山药试管苗缓慢生长的保存技术体系。研究了PP333、B9、甘露醇和活性炭在常温和低温下对试管苗保存效果的影响,结果显示PP333结合低温效果最好,铁棍山药、47号山药和B号山药三种基因型的最佳PP333浓度分别为5.0 mg·L-1、2.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1,保存6个月后成活率分别为100％、100％和95％。
4、建立了山药试管苗带芽节段分步冷冻法、玻璃化法和包埋玻璃化法超低温保存技术体系。采用的带芽节段均来自于室温下培养60 d并于4℃锻炼7 d的试管苗。分步冷冻法:将带芽节段在MS+10％DMSO中预培养7 d,在10％DMSO+5％M+5％PVP的冰冻保护剂中,按照0℃2h→-20℃2h→-80℃2h程序逐级降温后投入液氮,保存后37℃水浴快速化冻,用MS+5％S的洗涤液洗涤4次,每次10 min;玻璃化法:将带芽节段在MS+10％DMSO中预培养7 d,分别用60％和100％PVS1在0℃下过渡、脱水各60min,投入液氮,保存后37℃水浴快速化冻,用MS+7％S的洗涤液洗涤4次,每次10 min；包埋玻璃化法:将带芽节段在含10.3％S、13.6％S、17.1％S的MS培养基内各培养1 d,用褐藻酸钠和氯化钙包埋带芽节段,包埋珠在室温下用MS+2 mol·L-1甘油+13.6％S装载60 min,0℃下用PVS2脱水60min,更换新的PVS2,投入液氮,保存后在40℃水浴中快速化冻,用MS+40.8％S和MS+34.2％S的洗涤液各洗涤一次,每次停留10min。将三种方法洗涤后的带芽节段接种于再生培养基中,于暗处培养一段时间后,转入光下培养,可再生植株。超低温保存后成活率随保存方法和基因型而异,分步冷冻法最高成活率为66％,玻璃化法最高成活率为79％,包埋玻璃化法最高成活率为64.6％。
5、山药种质资源DNA指纹图谱的构建。运用RAPD分子标记技术,采用4条随机引物对不同基因型山药的基因组DNA进行扩增,并对电泳图谱中的特异性条带进行分析,构建了铁棍山药、小叶山药等18种基因型山药的DNA指纹图谱。