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表皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF)是一种促进细胞增殖、分化和迁移的多肽。EGF能刺激细胞增殖、分化和迁移，参与一系列的生理过程如胚胎发育、组织再生、内分泌系统功能和调节、伤口愈合、胃液分泌等，并且在细胞信号传导过程中起重要做用，EGF及其受体对于肿瘤的发生也有重要的关系。目前人表皮细胞生长因子已经广泛运用于医疗及化妆品等领域中，而犬的表皮细胞生长因子的研究开发，将对犬的医疗保健等方面有着重要的意义。1不同品种犬表皮生长因子基因的克隆与分子特征分析实验目的主要是克隆不同品种犬的表皮生长因子（canine epidermal growthfactor, cEGF）基因，分析不同品种犬EGF基因的分子特征及犬EGF与几种常见物种的EGF差异性比较。收集11个常见的不同品种犬的血样，提取基因组，采用PCR方法分别扩增出编码cEGF基因的N端和C端结构域的犬32号染色体20和21号外显子，插入pMDTM18-T Vector，构建重组质粒，并转化大肠杆菌DH5α感受态，PCR鉴定阳性克隆后送样测序，用20和21号外显子序列拼接出cEGF全长，采用BLAST和DNAStar软件分析序列相互关系特征。结果成功扩增出11种不同品种犬EGF编码基因，全长为156bp，编码52个氨基酸，犬EGF基因序列同源性在97.4%-100%之间。根据cEGF编码基因推导氨基酸序列同源性为98.1%-100%，除了杜宾犬（Doberman Pinscher）EGF氨基酸在52位点处R→F，其余的氨基酸序列都一致。cEGF氨基酸序列与几种其他动物及人EGF相比较发现：cEGF与家猫EGF(Felis catus EGF)同源性很高，达到94.2%。结论不同品种犬的EGF编码基因同源性很高、非常保守，犬EGF与家猫EGF同源性很高。2犬表皮生长因子的原核表达、纯化、活性鉴定及多抗的制备用DNA重组技术合成犬表皮生长因子（canine epidermal growth factor, cEGF）基因，在大肠杆菌中高效表达，检测重组蛋白的生物活性，制备cEGF兔源多抗血清。设计4条引物，用SOE-PCR合成cEGF基因，将cEGF基因克隆至表达载体pET-24a、pET-28a进行原核表达，对表达得到的重组蛋白纯化，MTT法测定重组蛋白的生物活性，分析标融合签蛋白的大小对重组蛋白生物活性的影响。纯化后的rcEGF免疫日本大耳白兔，制备兔源多抗血清，用间接ELISA法检测所得多克隆抗体的效价。SOE-PCR合成得到cEGF基因，大小为156bp，编码52个氨基酸，构建了3个融合表达质粒，分别编码61、75、95个氨基酸。IPTG诱导表达，大部分表达为包涵体，通过变性、纯化、复性的过程后，每1L菌液得到重组蛋白rcEGF1、rcEGF2、rcEGF3分别为5.2mg、16.1mg、9.3mg，MTT法实验表明rcEGF1、rcEGF2、rcEGF3的生物活性依次降低。用间接ELISA法检测所得多克隆抗体的效价为：兔血清效价1：51200。结果表明，原核表达含一个6×His纯化标签的rcEGF，具有生物活性。标签蛋白的大小影响重组蛋白的生物活性。3犬表皮生长因子的酵母表达。将cEGF基因克隆至酵母表达载体pPICZαA，构建酵母表达质粒pPICZαA-cEGF，将质粒pPICZαA-cEGF电转化至巴斯德毕赤酵母菌X33，经过甲醇诱导表达，SDS-PAGE检测，结果表明cEGF基因片段分泌表达。