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猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的猪的一种急性肠道传染病,以呕吐、腹泻、食欲不振和严重脱水为特征。PED感染率比较高,幼猪的感染率高达100%,七日龄以内幼猪的感染死亡率高达80%100%。2010年,我国再次大规模爆发PEDV感染。经过鉴定分析,这次流行株主要为PEDV S基因S1区出现多处碱基的丢失和插入,并伴随大量点突变,使得现有的疫苗已经不能提供免疫保护,给养猪业带来了巨大的损失。因此,研究新型高效的疫苗成为亟待解决的问题。S蛋白为PEDV的主要结构蛋白,分为S1和S2两个区域。S1是免疫优势区,参与特异性受体识别与结合,包含多个中和抗原表位,常作为PEDV基因工程疫苗研究中的候选蛋白。PEDV主要在肠道定植,因此,唯有通过刺激机体产生黏膜免疫可以预防该病的发生。为了实现良好的肠道黏膜免疫应答,本研究选用NCBI上公布的CH/JLCC/2011变异毒株（Sequence ID:JQ638920.1）合成S1基因,序列的两端添加Flag标签和NcoI、SacI酶切位点,将克隆有PEDV S1基因的重组质粒pET-28a-S1和表达载体pNZ8149用NcoI、SacI进行双酶切,取基因和载体的纯化产物进行连接,电转入乳酸乳球菌NZ3900。用Elliker培养基进行筛选,获得了阳性重组乳酸乳球菌pNZ8149-S1/NZ3900。将重组菌在M17培养基中30℃静置厌氧培养,用终浓度为1ng/mL的Nisin进行诱导,经SDS-PAGE、Western-blot检测,目的蛋白获得表达,大小约为89kDa。IFA实验结果表明,pNZ8149-S1/NZ3900菌体表面呈现绿色荧光,空载体pNZ8149/NZ3900菌体表面未出现绿色荧光,说明重组乳酸乳球菌表达的蛋白定位于菌体的表面且具有反应原性。为了探索pNZ8149-S1/NZ3900重组乳酸乳球菌对机体免疫应答水平的影响,本实验选取BALB/c小鼠为试验动物,随机分为pNZ8149-S1/NZ3900组、pNZ8149/NZ3900空载体对照、NZ3900宿主菌和PBS对照组。每只小鼠口服免疫1.3×1010CFU的乳酸乳球菌或200μL PBS,共进行三次免疫,每次免疫之间间隔两周,一次持续免疫三天、每天一次。采集不同时间点各组小鼠血清、粪便、大肠和小肠内容物,S、MLN和PP结,ELISA法检测所采集样品中的sIgA、IgG含量,MTT法检测脾淋巴细胞增殖情况,ELISA法测IL-4、IFN-γ的水平,流式细胞术检测T淋巴细胞的活化情况。检测结果显示,pNZ8149-S1/NZ3900免疫组小鼠sIgA和IgG抗体水平显著高于pNZ8149/NZ3900空载体对照、NZ3900宿主菌和PBS对照组（p<0.01）,而pNZ8149/NZ3900、NZ3900和PBS对照组之间差异不显著。脾淋巴细胞增殖实验结果表明,5μg/mL的PEDV S1抗原具有显著刺激脾淋巴细胞增殖的作用（p<0.01）。IL-4、IFN-γ的水平表明,重组菌可以刺激小鼠机体产生Th1/Th2混合型细胞免疫应答。流式细胞术检测结果显示,pNZ8149-S1/NZ3900重组菌可以促进机体产生一定水平的细胞免疫水平应答。综上所述,本实验成功构建并表达了重组乳酸乳球菌pNZ8149-S1/NZ3900,经动物实验证实,重组菌可以提高小鼠机体的抗PEDV黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫水平,为PEDV新型口服疫苗的研究做出了有益参考。