论文部分内容阅读
目的应用盲肠结扎穿孔术建立脓毒症小鼠模型后,通过microRNA芯片筛选出脓毒症小鼠和正常小鼠心肌组织中差异性表达的microRNA,预测差异性表达microRNA的靶基因。方法(1)建立脓毒症小鼠模型和心脏分离:选用清洁级8周龄雄性C57BL/6小鼠进行实验。应用盲肠结扎穿孔术建立脓毒症小鼠模型,建模后24小时,从存活的小鼠中随机选取3只作为实验组,同时取3只雄性C57BL/6健康小鼠作为对照组。将小鼠称重后麻醉,开胸,暴露搏动的心脏,灌注针经心尖、左心室进入主动脉,同时在右心耳处剪出一个小口,用预先准备好的生理盐水充分灌洗心脏,快速取出心脏,除去心脏周围组织,并用滤纸吸干心脏表面及室腔内的液体,立即装入预冷的冻存管中,并迅速放入液氮中至少5min,后放入-80℃冰箱中冷冻保存。(2)总RNA提取和RNA质量检测:取心肌组织约100mg~200mg用于提取总RNA。应用mir Vana?microRNA Isolation Kit(AM1561)对总RNA进行纯化并定量。取1μg纯化后的RNA进行RNA质量鉴定,应用紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度,应用1.3%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳测定RNA的完整性。(3)microRNA芯片筛选:取纯化后的RNA约2μg,利用Flash Tag?Biotin RNA标记试剂盒进行芯片杂交、染色和扫描,对两组样本数据进行聚类分析和SAM分析,筛选出差异性表达的microRNA。(4)靶基因预测:应用靶基因预测软件的数据库,预测差异性表达microRNA的靶基因。结果(1)脓毒症小鼠模型建立:10只脓毒症小鼠建模后24小时,死亡5只,存活5只,病死率为50%。实验组小鼠出现毛发竖立、结膜炎、腹泻、昏睡等表现。(2)总RNA质量鉴定结果:RNA纯度A260/280≥1.90,RNA总量≥1μg,RNA完整性28S:18S r RNA条带亮度大于或接近2:1,样品纯度、总量和完整性均满足表达谱芯片实验要求,可进行后续芯片实验。(3)microRNA芯片筛选结果:通过microRNA芯片的筛选,比较675个microRNA。根据差异基因筛选的标准:q-value≤5%且Fold Change≥2或≤0.5,对microRNA芯片结果分析:与对照组相比,在脓毒症小鼠心肌组织中共筛选出6个差异性表达的microRNA,其中mmu-mi R-5620-3p、mmu-mi R-3968和mmu-mi R-215-5p表达上调,mmu-mi R-16-1-3p、mmu-mi R-200c-3p和mmu-mi R-122-5p表达下调。(4)预测差异性表达microRNA的靶基因:mi R-215的靶基因有CDKN1A、ZEB2和CTNNBIP1,mi R-16的靶基因有BCL2、CCND1、CCNE1和WNT3A,mi R-200c的靶基因为ZEB1,mi R-122的靶基因有BCL2和SOX11。结论(1)盲肠结扎穿孔术能成功建立脓毒症小鼠模型。(2)在脓毒症小鼠心肌组织中存在上调和下调差异性表达的microRNA。(3)差异性表达的microRNA作用的靶基因与细胞增殖、分化和凋亡等密切相关,这有助于阐明脓毒症的作用机制,并为脓毒症的进一步研究和治疗提供坚实的实验和理论基础。