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脑血管病是威胁人类生命的主要疾病之一。目前很多研究证实动脉粥样硬化易损斑块的破裂和栓子的脱落是引起急性心血管事件及脑卒中的重要原因,颈动脉斑块造成的血管狭窄甚至闭塞、斑块的突然破裂导致急性的动脉阻塞都可以引起缺血性脑卒中。因此,颈动脉斑块的早期识别、斑块稳定性的评价以及干预阻止其进展对于心脑血管病的防治意义重大。第一部分TLR4在动脉粥样硬化斑块形成和进展中的作用机制目的:观察动脉粥样硬化斑块(AP)形成和发展中Toll样受体4(TLR4)表达的变化,探讨TLR4在AP形成和发展的过程中的作用机制。材料与方法:8周龄ApoE(-/-)小鼠20只,适应性喂养1周后,随机分为4组,每组5只,包括对照组、普通饮食组、10周模型组和20周模型组。对照组处死,普通饮食组给予普通饲料喂养10周后处死,10周模型组和20周模型组分别予高脂饮食喂养10周和20周后处死,取血检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、氧化型低密度脂蛋白(oxLDL),留取颈动脉和主动脉标本,观察斑块情况,对标本进行HE染色、油红O染色、弹力纤维染色以及天狼猩红染色。并通过免疫组化检测颈动脉斑块巨噬细胞(MOMA-2)、平滑肌肌动蛋白(α-actin)蛋白水平、TLR4、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达。结果:1.普通饲料组TC、TG、oxLDL水平较对照组升高(P<0.05);10周模型组较普通饲料组血脂明显升高(P<0.05),AP形成。2.20周模型组较对照组和10周模型组血清TC、TG、oxLDL水平升高(P<0.05),AP明显增多,斑块脂质成分增加,弹力纤维中断、减少,胶原成分减少,巨噬细胞增加,平滑肌细胞减少。3.20周模型组较对照组和10周模型组颈动脉斑块TLR4、IL-1β、IL-6和TNF-α表达增加(P<0.05)。结论:1.ApoE(-/-)小鼠高脂饮食可以成功建立AP动脉的动物模型,且高脂饮食的时间越长,AP越明显。2.ApoE(-/-)小鼠通过高脂饮食建立动脉粥样硬化动物模型后oxLDL水平增高,动脉及斑块炎症因子水平增高,巨噬细胞增多,血管平滑肌细胞减少,胶原合成减少,从而促进斑块的进展,并降低斑块的稳定性。3.apoe(-/-)小鼠随着动脉粥样硬化的加剧,tlr4和炎性因子的表达增加,可能参与促进动脉粥样硬化斑块进展。第二部分tlr4诱导自噬与动脉粥样硬化斑块稳定性的关系目的:观察apoe(-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块tlr4表达与自噬的关系,探讨tlr4诱导自噬对动脉粥样硬化斑块(ap)稳定性的影响。方法:8周龄apoe(-/-)小鼠24只,适应性喂养1周后,给予高脂饮食10周后随机分为3组,每组8只,包括lps组、对照组、tak组。lps组给予lps(1mg/kg)腹腔注射,每周2次;tak组给予tak-242(0.3mg/kg)腹腔注射,每周2次;对照组给予相应的等容积的生理盐水腹腔注射,每周2次。三组仍继续高脂饮食,腹腔注射10周后取血检测血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、氧化型低密度脂蛋白(oxldl)。留取颈动脉和主动脉标本,观察斑块情况,对标本进行he染色、油红o染色、弹力纤维染色以及天狼猩红染色。并通过免疫组化检测斑块内巨噬细胞(moma-2)、平滑肌肌动蛋白(α-actin)蛋白水平、toll样受体4(tlr4)、il-1β、il-6、tnf-α的表达。westernblot检测lc3Ⅱ/Ⅰ,beclin-1,p62水平。结果:1.lps组小鼠血清tc、tg、oxldl水平高于对照组和tak组小鼠(p<0.05);tak组tg、oxldl水平低于对照组(p<0.05)。2.lps组小鼠ap较对照组和tak组巨噬细胞含量(mamo-2免疫组化染色阳性率)增多(p<0.05),tak组较对照组小鼠ap巨噬细胞含量减少(p<0.05)。lps组较对照组和tak小鼠ap平滑肌细胞含量(α-actin免疫组化染色阳性率)减少(p<0.05);tak组较对照组平滑肌含量增加(p<0.05)。3.lps组小鼠ap与对照组和tak组比较,tlr4、il-1β、il-6、tnf-α的表达增加(p<0.05);tak组较对照组tlr4、il-1β、il-6、tnf-α的表达减少(p<0.05)。4.对照组、lps组和tak组小鼠动脉lc3Ⅱ/Ⅰ、p62和beclin-1蛋白表达量有差异(p<0.05)。lps组较对照组和tak组lc3Ⅱ/Ⅰ表达增加(p<0.001)。lps组较对照组和tak组beclin-1表达增加(p<0.001);tak组较对照组beclin-1表达减少(p<0.001)。lps组较对照组和tak组p62表达增加(p<0.001);tak组较对照组p62表达增加(p<0.01)。结论1.lps可以上调aptlr4的表达,tak-242下调tlr4的表达。2.lps上调tlr4表达后,促进炎症因子的分泌,加重脂代谢紊乱,自噬水平明显增高,但p62蛋白水平同时升高,可能lps导致过度自噬而出现自噬功能异常,反而加剧了ap进展和易损性增加。3.tak-242通过下调tlr4的表达,减少巨噬细胞,增加平滑肌细胞的含量,增加斑块的稳定性。第三部分阿托伐他汀及联合普罗布考对tlr4诱导自噬的影响目的:评价阿托伐他汀及联合普罗布考对tlr4诱导的自噬的影响,探讨其抗动脉粥样硬化的作用机制。方法:8周龄apoe(-/-)小鼠24只,适应性喂养1周后,予以高脂饮食10周,再随机分为3组,每组8只,包括对照组、他汀组、联合组。对照组给予等容积超纯水灌胃10周,每天1次;他汀组,高脂饮食的同时给予阿托伐他汀(10mg/kg/d)灌胃10周,每天1次;(3)联合组,换喂食普罗布考饲料,同时给予阿托伐他汀(10mg/kg/d)灌胃10周,每天1次。取血检测血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、氧化型低密度脂蛋白(oxldl)。留取颈动脉和主动脉标本,观察斑块情况,对标本进行he染色、油红o染色、弹力纤维染色和天狼猩红染色。并通过免疫组化检测斑块内巨噬细胞(moma-2)、平滑肌肌动蛋白(α-actin)蛋白水平、toll样受体4(tlr4)、il-1β、il-6、tnf-α的表达。westernblot检测lc3Ⅱ/Ⅰ,beclin-1,p62水平。结果:1.他汀组和联合组tc和oxldl水平较对照组降低,联合组较他汀组oxldl水平降低(p<0.05)。2.他汀组和联合组与对照组比较,颈动脉ap弹力纤维较完整,脂质含量减少,胶原含量增加,tlr4、il-1β、il-6、tnf-α的表达减低、平滑肌细胞增加,易损指数降低(p<0.05)。联合组较他汀组小鼠颈动脉ap巨噬细胞含量减少,易损指数降低(p<0.05)。3.对照组、他汀组和联合组小鼠动脉lc3Ⅱ/Ⅰ、p62和beclin-1蛋白表达量有差异(P<0.05)。他汀组和联合组与较对照组动脉Beclin-1表达增加(P<0.05);联合组较对照组和他汀组LC3Ⅱ/Ⅰ表达增加,P62表达减少(P<0.05)。结论:1.阿托伐他汀可下调TLR4表达,降低血脂,抑制氧化应激和炎症因子的分泌,增加斑块的稳定性。2.联合应用阿托伐他汀和普罗布考较单独应用阿托伐他汀具有更强的抑制氧化应激的作用,减少巨噬细胞含量,适当地增加了自噬水平,发挥更强的抗动脉粥样硬化作用,更有效地增加了斑块的稳定性。