植物细胞内转录调控是调控网络中最重要的一环,而基因的转录主要是由转录因子调控。WRKY转录因子是植物转录因子中的一大类,参与植物的生物和非生物胁迫应答。我们前期的研究发现了一个对高温敏感的水稻WRKY转录因子,将其命名为 OsHsHS(Oryza sativa Hypersensitive to Heat Shock),与大多数WRKY转录因子相似,位于细胞核中。本研究通过改变OsHsHS基因的表达,对OsHsHS的功能进行研究。构建过表达、RNAi和CRISPR/Cas9载体,获得转基因植株。采用RT-PCR、Northern Blot检测分析过表达和RNAi植株,得到两个有效的过表达株系和一个RNAi株系。同时也得到了部分CRISPR/Cas9转基因植株。为进一步揭示OSHsHS基因的功能,我们检测了不同处理条件下,野生型苗期OsHsHS基因表达模型。Northern Blot结果表明上部的叶片和叶鞘的表达量高于下部,且OsHsHS基因可以受JA、ABA、高温、低温、干旱以及高盐的诱导。同时也检测了热处理后,热相关标记基因OsHsfA2d和病程相关基因Ospr1a的表达。有意思的是,热处理后OsHsfA2d基因的表达受到了抑制,而OsPr1a基因表达迅速提高,而后降低。为了找出与OsHsHS互作的蛋白,前期对酵母双杂交文库进行筛选,但没有找到与之互作的蛋白质。通过文献分析,发现拟南芥中的一些WRKY转录因子可以与VQ蛋白质互作。有鉴于此,本研究采用酵母双杂交实验检测了 9个可能与OsHsHS互作的水稻VQ蛋白,发现OsHsHS与VQ8、VQ12、VQ15、VQ33存在互作,互作有强有弱。OsHsHS基因编码一个WRKY转录因子,WRKY转录因子能够和W-box 结合,本研究采用 EMSA(electrophoretic mobility shift assay)实验验证OsHsHS是否能与W-box结合,结果表明OsHsHS能微弱的和W-box结合。前期实验显示OsHsHS可以调控水稻ROF基因表达,序列分析发现该基因的启动子区含有W-box序列,EMSA检测同样发现OsHsHS能够和ROF基因启动子中W-box结合,但结合偏弱。推测可能存在其它序列影响OsHsHS蛋白与启动子结合。因此,本研究采用SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)技术,筛选出与OsHsHS结合的DNA片段,以期获得OsHsHS的可能结合序列。值得一提的是,我们利用该技术对另外两个蛋白WRKY45和Myb42也进行了筛选,其中Myb42蛋白结合片段的测序结果分析显示存在一个保守的GATHY基序,可能是Myb42蛋白特异的结合序列,但没有找到WRKY45和OsHsHS的结合基序。ChIP(Chromatin Immunoprecipitation)可以体内检测转录因子与 DNA 的互作,结合二代测序可以高效检测出转录因子直接调控的基因,而抗体是制约该实验成功的重要因素。我们尝试自行制备ChIP实验所需的抗体,Western Blot结果显示抗体可以高效和特异地结合OsHsHS.利用该抗体可以尝试ChIP实验,找出OsHsHS直接调控的基因。综合上述研究结果,OsHsHS基因可以参与多种非生物胁迫应答反应,是一个多功能蛋白。OsHsHS与多个VQ蛋白存在互作,可进一步分析与其相互作用的VQ蛋白功能以及作用机制,揭示信号传导可能的途径,完善OsHsHS调控网络。