核酸适配体是一种长度较短的寡聚核酸序列,它能够以类似抗体的识别方式与靶标相互作用。由于其具有保存期长、批次间变异小、免疫原性低/无免疫原性、易进行化学修饰以增强亲和力和特异性等诸多优点,因此适配体在生物分析、食品检测、药物输送、生物传感和功能基因组学等诸多应用领域拥有巨大发展潜力。核酸适配体主要通过“配体指数富集的体外系统进化技术”,即SELEX技术筛选获得。经过多年的技术改进,科学家们在经典SELEX技术的基础上提出了大量优化的SELEX筛选策略。尽管有了这些技术改进,但这些策略仍然具有筛选周期长、化学改性操作繁琐、其化学修饰易改变分子空间结构等诸多缺陷。由于在筛选前对ssDNA文库或靶标的化学修饰可能会改变原始分子的空间构型,从而阻断适体与靶标识别的真正结合位点,影响它们的结合过程。为了克服以上缺陷,本研究基于凝胶电泳分离原理建立了一种无标记原位筛选策略,从随机单链DNA文库中筛选出一种典型的模式蛋白—牛血清白蛋白(BSA)的潜在特异性核酸适体,然后利用筛选所得的适配体建立荧光生物传感器检测实际样品梨汁中牛血清白蛋白的含量。主要研究内容如下:(1)建立无标记原位筛选策略,首先将BSA预先与琼脂糖凝胶混合后,利用电泳迁移率变化分析的原理经过8轮循环筛选获得可识别 BSA 的特异性适配体(No.1、No.2、No.3、No.4、No.5、No.6、No.7、No.8)。后续采用传统SELEX技术获得4条可识别BSA的适体S1、S2、S3、S4。这12条单链适体对BSA表现出的亲和性较高且彼此间同源性较低。其中No.4的解离常数(Kd)值最低为69.44±7.6nM,S1的解离常数值次之为87.51 ± 17.89nM。通过比较,发现本文提出的无标记原位筛选策略可以有效地筛选靶标的特异性适配体,且其亲和力更高。(2)利用aptamer No.4建立了用于检测BSA含量的荧光生物传感器,并优化了体系的各种反应条件。互补荧光探针最适长度为13bp,核酸适配体aptamer No.4最适添加量为3μM,dsDNA和磁珠孵育的最适时长为80min,BSA的最适检测时长为30min。此荧光适体传感器的线性检测范围是1-120ng/mL,最低检测限(LOD)是0.24ng/mL。将牛血清白蛋白添加到梨汁样品中进行BSA检测,其回收率介于96%-99%。